[发明专利]用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法

权利要求书

1.一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，试验材料的培养，所述试验材料为黄瓜幼苗；

黄瓜幼苗的地上部组织材料对培养条件无特殊要求，地下部组织材料的培养方式为组培、水培、沙培和土培；所述土培为采用细土培养；

步骤2，试验材料的取样与固定；

在冰上取样，切取3～4cm长度的黄瓜幼苗的茎和包含侧根的根系片段作为植物样品，进行包埋得到包埋样品，对包埋样品进行修块切分，得到组织样品；

步骤3，目标基因的探针制备，并进行探针纯化；

探针的转录模版由模版片段和T7/Sp6启动子序列两部分组成，正义探针与反义探针与启动子连接方向相反，正义探针是目标基因的阴性对照，反义探针是目标基因的互补序列，与靶基因结合显示目标基因的位置，它们是带目标基因的转录模版体外转录产物；

根据目标基因的mRNA序列长度和荧光定量qPCR结果，选取GG起始，GC含量为40％～70％的目标基因片段做模版片段；

步骤4，杂交切片的准备；

对步骤2得到的组织样品，通过切片机制得石蜡切片，并对石蜡切片进行筛选，筛选后先后进行摊片、烘片，得到杂交切片；

切片过程中，及时检查并清理刀片上的蜡渍，避免划痕导致的样品碎裂；

经过筛选后的石蜡切片，平放于37℃RNase-free水中进行摊片，待石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，再用毛笔轻轻拖起摊在载玻片上，毛笔轻压赶走气泡，再用吸水纸轻压吸去水分，以此减少烘片的时间并提升烘片的效果，避免后期样品与载玻片分离，得到杂交切片；

步骤5，杂交预处理；

对杂交切片进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来；将最终得到的杂交切片样品保存在4℃冰箱，置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上；

步骤6，杂交孵育封片：

对步骤5得到的杂交切片样品，先使用一抗进行第一次杂交孵育，然后使用二抗进行第二次杂交孵育，所述一抗是DIG-11-UTP探针，二抗是DIG-AP；使用含抗体的RNA杂交液淋洗孵育处理后的杂交切片样品，然后使用含抗体的RNA杂交液封片以进行孵育；

步骤7，显色反应镜检：

当黄瓜幼苗期基因的荧光定量PCR的CQ值为15≤CQ＜25,内参基因CQ值为15时，在显色反应开始6h内进行一次镜检查看杂交信号；当黄瓜幼苗期基因的荧光定量PCR的CQ值为25≤CQ≤30，内参基因CQ值为15时，在第二天开始，每天上午、下午或晚上各进行一天2次的镜检；

镜检时避光，将步骤6中封片后的杂交切片样品置于NBT/BCIP显色底物缓冲液中分开，用NBT/BCIP显色底物缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号分子，终止显色反应；否则，用NBT/BCIP显色底物缓冲液重新冲洗样品，然后将两片载玻片重新对粘并放回考普林杯中继续反应；

步骤8，反应终止后处理：

对于观察到杂交信号的组织样本，用清水终止显色反应，然后置于室温晾干，最后每张载玻片直接用90μl中性树脂：二甲苯为1:1的混合液进行封片，实验结果永久保存；

步骤6中，第一次杂交孵育的过程为：

首先，将步骤5得到的杂交切片样品，从染色架移至玻片板上于室温晾干5-10min，至杂交切片样品呈纯白色；同时，按照每张杂交切片样品30μl稀释后探针的用量进行计算，分别稀释正义探针和反义探针，所述30μl稀释后的探针为2μl正义探针或反义探针+28μl 50％甲酰胺溶液的比例；将稀释后的正义探针或反义探针混匀，80℃变性2min，立即置于冰上2-3min，瞬离30s；

然后按照120μl/片计算后加入RNA杂交液，用剪过的枪头吸打混匀；接着，在免疫组化湿盒中加入2×SSC/50％甲酰胺溶液覆盖整个湿盒底；然后，每张载玻片加入杂交混合液135μl，待液体完全覆盖样品后盖上盖玻片，随即放入免疫组化湿盒中；最后，待所有载玻片全部放入免疫组化湿盒后，将免疫组化湿盒中用胶带密封，置于50～55℃保温箱过夜；所述杂交混合液为：每30μl的稀释后的探针+120μl RNA杂交液；

所述RNA杂交液为：使用RNase-free水配置，1ml RNA杂交液添加的底物用量为500μl100％甲酰胺、200μl 50％硫酸葡聚糖、170μl RNase-free水、100μl 10×Salts、20μl 50×denhardt's、10μl 100mg/ml tRNA，根据杂交切片的数目配置相应的用量，其中硫酸葡聚糖粘稠，移液枪吸用速度不宜过快，并且充分吹打混匀；

所述10×Salts溶液：由RNase-free水配置，溶液底物工作浓度为49mM Na₂HPO₄·51mMpH 6.8的NaH₂PO₄缓冲液、3M NaCl、50mM EDTA、pH 8.0的Tris·HCl，能够在-20℃长期保存；

所述50％硫酸葡聚糖：用60℃加热的RNase-free水配置，10ml RNase-free水加入0.5g硫酸葡聚糖，充分混匀溶解后可在-20℃长期保存；

所述2×SSC/50％甲酰胺：RNase-free水、20×SSC缓冲液和100％甲酰胺配置，稀释后溶液底物工作浓度为2×SSC，50％甲酰胺；

步骤6中，在使用一抗进行杂交孵育后，使用二抗进行杂交孵育前对样品进行处理，具体处理过程如下：

将使用一抗进行杂交孵育后的样品置于在55℃预热的Buffer1溶液中去掉盖玻片，然后Buffer1溶液55℃反应1h→Buffer1溶液55℃反应1h→Buffer2溶液37℃反应5min→Buffer2溶液37℃反应5min→Buffer2+RNaseA溶液37℃反应30min→Buffer2溶液37℃反应5min→Buffer2溶液37℃反应5min→Buffer1溶液55℃反应1h→TBS摇床5min→Buffer3溶液摇床1h→Buffer4溶液摇床45min；

然后使用DIG-AP抗体溶液进行第二次杂交孵育：DIG-AP抗体杂交孵育→在Buffer 4溶液中去盖玻片后放置干净染色架→Buffer4溶液摇床15min→Buffer4溶液摇床15min→Buffer4溶液摇床15min→Buffer4溶液摇床15min→Buffer5溶液摇床5min→Buffer5溶液摇床5min，最后，在避光环境中，用120μl NBT/BCIP显色底物溶液冲洗一次样品切片并将载玻片两两之间对贴在一起，转入底部加有2ml NBT/BCIP显色底物缓冲液的考普林杯，用锡箔纸包裹密封，放置于黑暗环境中，室温下进行显色反应；

所述DIG-AP杂交孵育具体为：每张载玻片用100μl含DIG-AP抗体溶液进行冲洗，然后再用100μl DIG-AP抗体溶液进行封片，放入加入Buffer4的湿盒中室温孵育2h；

所述Buffer 1溶液：根据实验用量配制，由蒸馏水稀释20×SSC为0.2×SSC；

所述Buffer 2溶液：由蒸馏水配置，三种溶液底物工作浓度为0.5mM NaCl、10mM pH7.5的Tris·HCl、1mM EDTA，根据实验用量配置；

所述Buffer 3溶液：由60℃1×TBS缓冲液配置，100ml 1×TBS缓冲液添加1g脱脂奶粉，在磁力搅拌器上60℃持续加热保证脱脂奶粉充分溶解；

所述Buffer 4溶液：由TBS缓冲液和蒸馏水配置，溶液底物工作浓度为1×TBS、1％BSA、0.3％Triton X-100，根据需求配置适当用量，在磁力搅拌器上常温搅拌使之充分混匀；

所述Buffer 5溶液：由蒸馏水配置，溶液底物工作浓度为0.1mM pH 9.5的Tris·HCl、100mM NaCl、50mMMgCl₂，根据需求配置用量，充分混匀；

所述DIG-AP抗体溶液：用Buffer 4稀释DIG-AP抗体1250倍，即10ml Buffer 4溶液添加8μl DIG-AP抗体，根据每张杂交切片样品200μl DIG-AP抗体溶液的用量计算所需配置总量。