[发明专利]一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法

摘要

本发明公开了一种高灵敏的检测microRNA的纸基光电化学传感器。利用蜡打印技术制备纸芯片，并在其亲水工作区域原位生长金纳米颗粒实现纸芯片的功能化，随后修饰氧化亚铜/硫化铋/钒酸铋三级敏化物，通过固定的发夹DNA链对microRNA进行捕获，通过双链特异性核酸酶的特异性的识别和酶切作用，实现对microRNA的信号放大，随后通过多支杂交链反应，在链的主干部分嵌入铂纳米粒子，枝干部分形成氯化血红素/G‑四联体结构，形成具有类过氧化氢酶生物特性的DNA多联体，进一步实现信号的放大，从而完成光电化学传感器的制备，实现对microRNA的超灵敏、准确检测。

主权项

1.一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130 ℃加热60秒使蜡融化并渗透整个色谱纸，形成疏水区域和亲水的工作区域；（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；（3）利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长金纳米颗粒，其具体步骤为：首先合成金纳米粒子：量取60‑90 mL二次水置于三口烧瓶中并加热到90 ℃，然后加入0.5‑0.9 mL质量分数为1%的氯金酸，继续水浴加热到96 ℃，待反应进行1 min后，立即加入2.5‑2.9 mL 质量分数为1%的柠檬酸钠，在磁力搅拌下反应15‑20 min，获得金纳米粒子溶液；然后采用“滴涂‑干燥”法首先在碳工作电极的工作区域的滴涂10‑20 μL金纳米粒子溶液，在室温下自然干燥，重复该操作3‑5次，取10‑20 μL新鲜制备的质量分数为1%的氯金酸和0.2 M的盐酸羟胺的混合溶液滴加到工作区域，所述的两种溶液体积比为1:1，在室温下生长20‑40 min后，用二次水清洗工作区域并在室温下自然干燥30 min；（4）利用电沉积方法将小面状的氧化亚铜（Cu₂O）修饰在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域并将钒酸铋（BiVO₄）/硫化铋（Bi₂S₃）复合物修饰在Cu₂O上；（5）将发夹DNA链S1固定在步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域，随后采用6‑巯基‑1‑己醇封闭活性位点，然后利用S1链捕获microRNA；（6）将目标检测物microRNA和双链特异性核酸酶依次在步骤（5）中获得的碳工作电极的工作区域进行孵育并用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤；（7）DNA多联体的形成：将发夹DNA分子1（H1）和发夹DNA分子2（H2）上溶解于pH 7.4的PBS中，滴加至步骤（6）中获得碳工作电极的工作区域，原位增殖形成多支杂交链，继续滴加氯化血红素，形成氯化血红素/G‑四联体结构，利用静电吸附作用将铂纳米粒子嵌入多支杂交链的主链中，形成具有生物催化作用的DNA多联体，可以催化H₂O₂分解生成O₂；（8）在步骤（7）中获得的碳工作电极的工作区域，滴加10 μL含有0.01 M H₂O₂的pH 7.4的PBS，在氙灯的照射下，以印制的Ag/AgCl电极作为参比电极，印制的碳电极作为对电极，步骤（3）中获得的碳工作电极作为工作电极，利用三电极系统，通过时间‑电流曲线法，在电压0.0 V下进行光电化学信号检测，绘制光电流强度与microRNA浓度的标准曲线，实现对microRNA的检测。