[发明专利]一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法

说明书

本发明公开了一种高灵敏的检测microRNA的纸基光电化学传感器。利用蜡打印技术制备纸芯片，并在其亲水工作区域原位生长金纳米颗粒实现纸芯片的功能化，随后修饰氧化亚铜/硫化铋/钒酸铋三级敏化物，通过固定的发夹DNA链对microRNA进行捕获，通过双链特异性核酸酶的特异性的识别和酶切作用，实现对microRNA的信号放大，随后通过多支杂交链反应，在链的主干部分嵌入铂纳米粒子，枝干部分形成氯化血红素/G‑四联体结构，形成具有类过氧化氢酶生物特性的DNA多联体，进一步实现信号的放大，从而完成光电化学传感器的制备，实现对microRNA的超灵敏、准确检测。

技术领域

本发明涉及microRNA分析检测技术、多支杂交链信号放大技术、DNA模拟酶催化技术、纸芯片技术及复合纳米材料技术领域，更具体地说是一种用于超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备。

背景技术

近年来，全球癌症发病率急剧上升，极大地威胁着人类健康，癌症早期检测越来越引起人们的重视。microRNA的变化可以调控基因的表达，是一种潜在的肿瘤标志物，因此microRNA的检测引起了人们的广泛关注。高灵敏度、高选择性测定microRNA对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗都具有非常重要的意义。到目前为止，一些检测方法像实时荧光定量聚合酶链式反应、诺瑟杂交、DNA微阵列法已经被发展并用于癌细胞的检测。但是这些方法费时，需要复杂的样品前处理和昂贵的仪器，因此仍急需发展一种超灵敏的、便携的、价格低廉的检测microRNA的分析方法。

氧化亚铜作为一种常用的光电材料，由于其无毒性、良好的催化活性、良好的生物相容性及独特的光和电性能，在光电化学传感器中被广泛地应用。提高光电化学传感器灵敏度的关键是提高光电材料的光电化学响应。将钒酸铋/硫化铋与氧化亚铜复合形成的三元复合物可以降低电子和空穴的复合速率，更有效地增强光电信号。

目前，DNA模拟酶在生物催化领域有着广泛的应用，与其它模拟酶相比，DNA模拟酶具有稳定好、易于合成复制、不易水解等特点，所以备受青睐。氯化血红素/G-四联体过氧化物模拟酶是近些年迅速发展起来的新兴DNA模拟酶，它能催化有H₂O₂参与的很多反应，所以以此为基础的信号放大技术在生物分析中被广泛地利用。此外，多支杂交链信号放大技术在近年来也引起了广泛的关注，通过多支杂交链反应，可以获得更长的带有多条分支的DNA双螺旋结构。为了进一步放大分析检测信号，我们将这两种信号放大技术相结合，利用铂纳米粒子和DNA链之间的静电吸附作用，在DNA双螺旋骨架上吸附更多的铂纳米粒子，多支杂交链上的支链在氯化血红素的存在下可以形成氯化血红素/G-四联体结构，更高地增强光电材料的光电化学响应，提高分析检测的灵敏度。

发明内容

本发明的目的是通过电沉积法制备具有大的比表面积、良好的生物相容性和光电性能的钒酸铋/硫化铋/氧化亚铜纸电极，将发夹DNA链固定在其表面，利用其捕获目标microRNA，通过双链特异性核酸酶的特异性识别和酶切作用，实现信号的循环放大，随后通过级联的多支杂交链反应，在链的主干部分嵌入铂纳米粒子，支干部分形成氯化血红素/G-四联体结构，进一步实现信号的放大，完成光电化学传感器的制备，实现对microRNA的超灵敏检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130 ℃加热50秒使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水区域和亲水的工作区域；

（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；