[发明专利]一种高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法在审
| 申请号： | 201910738896.6 | 申请日： | 2019-08-12 |
| 公开（公告）号： | CN110514631A | 公开（公告）日： | 2019-11-29 |
| 发明（设计）人： | 胡琴;岑瑶;柴煜莹;许贯虹;魏芳弟;杨静 | 申请（专利权）人： | 南京医科大学 |
| 主分类号： | G01N21/64 | 分类号： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 32200 南京经纬专利商标代理有限公司 | 代理人： | 曹翠珍<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 210029 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶的方法，步骤是：（1）以Fe3+为配位中心，BDC为有机配体，合成金属有机骨架Fe‑MIL‑88；（2）将荧光素标记的DNA单链FAM‑ssDNA与其互补链退火形成双链FAM‑dsDNA；（3）FAM‑dsDNA经培育后，被T4 PNK催化磷酸化，磷酸化的FAM‑dsDNA被λ exo裂解得到FAM‑ssDNA；（4）加入Fe‑MIL‑88，裂解得到FAM‑ssDNA荧光被猝灭，通过检测FAM的荧光强度来定量检测T4 PNK酶活性。灵敏简便，选择性好。 | ||
| 搜索关键词： | 荧光 裂解 灵敏 退火 荧光素标记 催化磷酸 定量检测 多核苷酸 合成金属 快速定量 配位中心 有机骨架 有机配体 激酶 互补链 磷酸化 酶活性 检测 双链 猝灭 培育 | ||
【主权项】：
1.一种高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤如下：/n（1）、合成金属有机骨架Fe-MIL-88：/n以Fe3+为配位中心，BDC为有机配体，通过油浴法得到金属有机骨架Fe-MIL-88；/n（2）、合成荧光素标记的FAM-dsDNA：/n将荧光素标记的DNA单链FAM-ssDNA与其互补链退火合成双链FAM-dsDNA；/n（3）、将细胞裂解液稀释，与步骤（2）所得FAM-dsDNA与 λ exo、 ATP加入至反应缓冲液中，在37 ℃条件下培育，进行FAM-dsDNA磷酸化反应及λ exo对磷酸化FAM-dsDNA的裂解得到FAM-ssDNA；/n（4）、将步骤（1）所得Fe-MIL-88加入到步骤（3）的混合溶液中，步骤（3）反应所得FAM-ssDNA荧光被猝灭；测定FAM荧光强度，根据标准曲线，得到T4 PNK酶活性。/n
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