[发明专利]一种高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法

说明书

本发明公开了一种高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶的方法，步骤是：（1）以Fe³⁺为配位中心，BDC为有机配体，合成金属有机骨架Fe‑MIL‑88；（2）将荧光素标记的DNA单链FAM‑ssDNA与其互补链退火形成双链FAM‑dsDNA；（3）FAM‑dsDNA经培育后，被T4 PNK催化磷酸化，磷酸化的FAM‑dsDNA被λ exo裂解得到FAM‑ssDNA；（4）加入Fe‑MIL‑88，裂解得到FAM‑ssDNA荧光被猝灭，通过检测FAM的荧光强度来定量检测T4 PNK酶活性。灵敏简便，选择性好。

技术领域

本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于偶联核酸外切酶反应和金属有机骨架（MOFs）—Fe-MIL-88的荧光传感纳米平台用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶（T4 PNK）的方法。

背景技术

T4多核苷酸激酶（T4 PNK）是由T4噬菌体所感染的大肠杆菌分离出来的酶。多核苷酸激酶（PNK）能够催化三磷酸腺苷（ATP）的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5′-OH末端并生成ADP的反应。在大多数正常的细胞活动包括DNA重组、复制、修复过程中，该磷酸化反应是一个必不可少的过程。一般来说，各种外源性和内源性因素包括电离辐射、化学物质和核酸酶等都可能导致核酸中5'端羟基化，从而损伤DNA，使基因组不稳定。多核苷酸激酶通过转移ATP的γ-磷酸基团至DNA末端从而负责修复核酸的5′端羟基自由基。PNK功能障碍可能导致许多细胞活动发生异常，如核酸代谢、DNA复制、DNA重组、DNA链损伤修复异常等，最终诱发多种人类疾病，包括沃纳综合征、Rothmund-Thomson综合征等。此外，由于PNK抑制剂能够提高人体肿瘤对γ-射线的敏感性，PNK可能为癌症放射治疗的一个有重大潜力的靶点。因此，建立一种高灵敏性，选择性好，便于操作的PNK活性检测及其抑制剂筛选的方法对基础生化研究、临床诊断和药物发现具有重要意义。

目前，用于检测PNK活性的常规分析方法主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影、自由基同位素³²p标记技术等，但这些方法存在复杂、耗时、潜在的放射性危害等缺陷。近年来，纳米通道生物传感器、电化学方法、比色法、荧光法等逐渐引起关注，其中荧光法以其简便、高效、灵敏等优点越来越受到人们的重视。

近年来，金属有机骨架材料（MOFs）作为一种具有晶体多孔性的新型材料，以其生物降解性、高比表面积和灵活可控的孔隙度，显示出了巨大的应用潜力。MOFs的常见应用包括气体储存、催化和药物传递。此外，利用MOFs具有良好的猝灭能力，可以用于构建荧光传感平台。MOFs通常对单链DNA（ssDNA）显示良好的吸附作用。这是由于MOFs包含的有机基团通常存在π电子共轭体系产生π-π相互作用的结果，同时为可能的氢键提供来源。然而，利用MOFs进行酶活性检测的例子很少，因此利用MOFs进行酶活性检测的应用尚待进一步探索。

发明内容

针对现有技术存在的设计复杂、操作繁琐、费用高等缺陷，本发明的目的在于提供一种基于偶联核酸外切酶反应和MOFs（Fe-MIL-88）的用于高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶的方法。利用λ exo对磷酸化DNA的裂解作用、Fe-MIL-88对ssDNA和双链DNA（dsDNA）的吸附能力的明显区别及其良好的荧光猝灭能力，检测细胞裂解液中T4 PNK酶活性。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速定量检测T4 PNK酶的方法，步骤如下：