[发明专利]一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法

摘要

本发明涉及生物诱变育种技术领域，尤其是一种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法。该方法步骤包括：菌悬液的制备、等离子体‑紫外线复合诱变、平板初筛、摇瓶复筛和发酵罐验证。本发明的种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，通过等离子体‑紫外复合诱变后，再采用平板初筛和摇瓶复筛，最终选育出了的β‑法尼烯高产突变菌株在发酵罐中β‑法尼烯的发酵单位比出发菌株提高了169.10％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。

主权项

1.一种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)菌悬液的制备：选取恒温培养箱内37℃下培养2天的EC‑16斜面菌苔，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，无菌锥形瓶置于震荡装置中，在30℃、220‑300r/min的条件下震荡5‑15min，使菌体分散，菌体分散后于2500‑5000r/min条件下离心10‑20min，弃上清液，将菌体用生理盐水悬浮并洗涤2‑3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为10⁶‑10⁹个/mL，备用；(2)等离子体‑紫外线复合诱变：在超净工作台中取3mL步骤(1)制得的菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯照射20‑120s，紫外灯功率为18W，灯距为30cm，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上，并按照ARTP‑M型诱变育种仪的操作流程进行处理，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM，等离子体发射源与样品间的距离为5‑20mm，处理时间设置为20‑70s；(3)平板初筛：将经过等离子体‑紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水稀释至10^‑6‑10^‑8稀释度，然后涂布于含0.3‑2.0g/L的异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养1‑2天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养1‑2天；(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC‑16的斜面菌苔1‑2cm²接种于种子培养基中，37℃、220‑300r/min条件下培养12‑20h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、220‑300r/min条件下震荡培养至OD600为0.6‑0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，随后加入正十二烷作为β‑法尼烯的萃取剂，萃取剂的用量达到体积分数为10‑35％(v/v)，设定培养温度为30℃，发酵72‑96h，测定β‑法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量最高的突变株进行发酵罐验证；(5)发酵罐验证：选取生长最好的斜面，用接种铲刮取1‑2cm²的菌苔接种于种子培养基中，37℃、220‑300r/min条件下培养12‑20h，然后按照5‑10％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为：发酵温度20‑30℃，初始转速220‑300r/min，根据溶氧变化逐步调整至450‑600r/min，通气量1:1VVM，发酵72‑96h，最后测定β‑法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。