[发明专利]一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法

说明书

本发明涉及生物诱变育种技术领域，尤其是一种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法。该方法步骤包括：菌悬液的制备、等离子体‑紫外线复合诱变、平板初筛、摇瓶复筛和发酵罐验证。本发明的种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，通过等离子体‑紫外复合诱变后，再采用平板初筛和摇瓶复筛，最终选育出了的β‑法尼烯高产突变菌株在发酵罐中β‑法尼烯的发酵单位比出发菌株提高了169.10％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。

技术领域

本发明涉及生物诱变育种技术领域，尤其是一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法。

背景技术

β-法尼烯(β-Farnesene，又称β-金合欢烯)是一种由三个异戊二烯组成的链状倍半萜烯化合物，在日化、农业、化工、能源和医药等领域有着广泛应用。尤其在医药领域，β-法尼烯是合成维生素E的前体物质异植物醇的重要原料。维生素E是全球市场容量最大的维生素类产品之一，每年全球约生产6万吨，维生素E前体异植物醇的原料供应一直被德国巴斯夫和荷兰帝斯曼所垄断，他们以柠檬醛作为中间体合成异植物醇，进而采用全化学合成工艺将三甲基氢醌和异植物醇进行环合反应生成维生素E。但全化学合成技术具有污染大，成本高的问题，人们一直试图寻找一种更节能环保的方法来生产维生素E，而采用微生物法合成β-法尼烯，能够使得维生素E的生产过程具有高转化率、低成本、低能耗等优势，在很大程度上降低了维生素E的生产成本具有，并且生产过程也更加绿色环保，可减少碳排放60％，因此高产β-法尼烯菌种的选育是企业降低发酵成本、提高产品市场竞争力的有效手段之一。

传统菌种选育方法有化学诱变剂(烷化剂、碱基类似物及亚硝酸等)和物理诱变(紫外线、X射线及快中子等)。其中，紫外诱变是最常用的人工诱变方法之一，其光谱范围在40-390nm。DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，当其吸收紫外光后形成嘧啶二聚体，从而阻碍碱基间的正常配对和DNA的复制，最终导致微生物的突变或死亡。然而，长期重复使用传统的诱变手段，往往导致突变效率低、突变谱窄和抗性饱和等难题。而常压室温等离子体(ARTP)诱变技术是近年发展起来的新诱变技术，具有操作便捷、突变率高、安全性好等优点，广泛应用于工业微生物诱变育种领域。此方法以氦气为工作气体的离子体源中富含多种活性能量粒子，这些活性粒子能够对微生物的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，克服前述现有技术的不足，以产β-法尼烯的大肠杆菌EC-16为出发菌株，通过采用常压室温等离子体(ARTP)诱变和紫外线诱变的复合诱变技术，并利用β-法尼烯代谢合成途径中的前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)作为筛选压力进一步提高突变株正突变率，进行组合诱变筛选，最终获得遗传性状稳定的β-法尼烯高产突变株。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，包括如下步骤：

(1)菌悬液的制备：选取恒温培养箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，无菌锥形瓶置于震荡装置中，在30℃、220-300r/min的条件下震荡5-15min，使菌体分散，菌体分散后于2500-5000r/min条件下离心10-20min，弃上清液，将菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为10⁶-10⁹个/mL，备用；