[发明专利]原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养及体外扩增方法

摘要

本发明公开了原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养及体外扩增方法，发明人取无菌新鲜肿瘤癌巢和癌旁组织，通过混合酶溶液进行消化分离，并接种于共刺激培养基中，从而实现淋巴细胞的培养和体外扩增。本发明在提取上解决了TIL提取数量和纯度低的关键问题，在培养上可使TIL往具有免疫活性的CD8+TIL亚型分化扩增，在扩增上，创造性地使用肝癌患者的外周血血浆和PBMC作饲养进行体外培养，并有效扩增TIL细胞，解决自体TIL过继免疫治疗引起的免疫排斥问题。在分选上，使用StemCell磁珠法分选出具有特异识别能力的CD8+TIL细胞，为下一步免疫治疗的临床研究奠基良好基础，具有显著的应用前景。

主权项

1.原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述方法包括：1)取无菌新鲜肿瘤癌巢和/或癌旁组织，浸泡于含有10％～15％FBS的RPMI1640培养基中；2)用PBS清洗两遍，剔除血块、脂肪及坏死组织，PBS再清洗一遍；3)剪成1mm³～3mm³大小，按组织重量：混合酶溶液体积＝1g：10ml～20ml的比例，将组织浸入混合酶溶液，置于恒温摇床消化，37±1℃消化30min～2h；4)加入HBSS液稀释，进行不连续密度梯度离心，800±100g离心30±10min。5)收集1±0.15密度层的淋巴细胞，加入PBS(含1％～5％FBS)稀释重悬，800±100g离心10±5min，去上清；6)加入含有1％～5％热失活FBS进行洗涤，1600±300rpm离心10±5min，去上清，重复一次。