[发明专利]原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养及体外扩增方法

权利要求书

1.原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述方法包括：

1)取无菌新鲜肿瘤癌巢和/或癌旁组织，浸泡于含有10％～15％FBS的RPMI1640培养基中；

2)用PBS清洗两遍，剔除血块、脂肪及坏死组织，PBS再清洗一遍；

3)剪成1mm³～3mm³大小，按组织重量：混合酶溶液体积＝1g：10ml～20ml的比例，将组织浸入混合酶溶液，置于恒温摇床消化，37±1℃消化30min～2h；

4)加入HBSS液稀释，进行不连续密度梯度离心，800±100g离心30±10min。

5)收集1±0.15密度层的淋巴细胞，加入PBS(含1％～5％FBS)稀释重悬，800±100g离心10±5min，去上清；

6)加入含有1％～5％热失活FBS进行洗涤，1600±300rpm离心10±5min，去上清，重复一次。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述混合酶溶液的成分包括：0.5±0.2mg/ml IV型胶原酶、0.1±0.05mg/ml透明质酸酶和/或0.02±0.01mg/ml I型DNA酶。

3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述混合酶溶液的成分具体为：0.5mg/ml IV型胶原酶、0.1mg/ml透明质酸酶和/或0.02mg/ml I型DNA酶。

4.使用权利要求1至3获得的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞进行培养和体外扩增的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将淋巴细胞接种于六孔板，使用1±0.5μg/ml抗CD3单克隆抗体OKT3，4℃包被过夜；

2)次日用PBS洗涤后，接种细胞于共刺激培养基上，CO₂培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的培养和体外扩增方法，其特征在于，所述共刺激培养基含有：10±5％热失活FBS和10000±2000IU/ml rIL-2的RPMI1640。

6.根据权利要求5所述的培养和体外扩增的方法，其特征在于，所述共刺激培养基还含有2±1μg/ml的抗CD28单克隆抗体。

7.根据权利要求4至6任一所述的培养和体外扩增方法，其特征在于，共刺激培养2天后，更换新的共刺激培养基，如此循环，至淋巴细胞密度生长至起始密度的3～10倍。

8.根据权利要7所述的培养和体外扩增方法，其特征在于，淋巴细胞达到目标浓度后，更换培养基，使用含10000±2000IU/ml rIL-2的培养基，培养8～15天，获得体外扩增后的淋巴细胞。