[发明专利]一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法

摘要

本发明公开了一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，本发明是以新生儿脐带为脐带间充质干细胞来源，使用去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物配制的培养基培养，收集上清液进一步采用差速离心法分离提取外泌体，纯度高，保证脐带间充质干细胞外泌体的来源；采用差速离心法制备外泌体，操作简单，适用于大规模生产；整个过程保证无菌无支原体污染，产品安全性更高。

主权项

1.一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)脐带间充质干细胞的培养采集新生儿脐带清洗后剥出华通胶剪至小块，铺于培养瓶中，置于培养箱中培养，8‑24h内添加完全培养基覆盖组织块培养，培养至第五天半换液，此后每隔2‑3天换液，细胞融合度达到70‑80％时，吸出组织块加到一个新的培养瓶中，补加培养基，待细胞从组织块周围爬出，融合度达到70％‑80％时进行传代，记为P1，持续传代操作，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代；2)脐带间充质干细胞的鉴定收集步骤1)获得的脐带间充质干细胞的二次贴壁细胞的P2代到P5代用PBS漂洗，离心去上清液，加入PBS重悬后分装，分别加入PE标记的鼠抗人CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105和同型对照，鉴定细胞表型；3)脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备选择步骤1)中制备的生长状态良好的脐带间充质干细胞用含8‑12％去除外泌体的FBS的完全培养基培养，细胞的融合度达到70‑80％时更换新的含8‑12％去除外泌体的FBS的完全培养基继续培养40‑56h，收集培养上清液；将上述上清液离心，去除细胞碎片获得上清液A；将上清液A继续离心去除完整细胞和死细胞，获得上清液B；将上清液B继续离心去除沉淀获得上清液C；0.22μm滤器过滤上清液C，获得上清液D；将上清液D放入超速离心机离心，弃上清，用预冷的PBS清洗获得的沉淀E；将沉淀E放入超速离心机离心弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。