[发明专利]一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法

说明书

本发明公开了一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，本发明是以新生儿脐带为脐带间充质干细胞来源，使用去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物配制的培养基培养，收集上清液进一步采用差速离心法分离提取外泌体，纯度高，保证脐带间充质干细胞外泌体的来源；采用差速离心法制备外泌体，操作简单，适用于大规模生产；整个过程保证无菌无支原体污染，产品安全性更高。

技术领域

本发明涉及一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，属于细胞培养领域。

背景技术

脐带间充质干细胞是来源于脐带华通胶组织的间充质干细胞，其来源广泛、免疫原性低，并具有多项分化、免疫调节和造血支持等功能，已经成为细胞治疗的种子细胞，在多种疾病包括糖尿病、神经系统疾病、肝病、心血管疾病、自身免疫疾病等疾病中都有很好的临床疗效，但其发挥作用的机制目前还不明确。最初认为脐带间充质干细胞植入人体后归巢到受损部位，进行细胞自我更新和定向分化，但后续研究表明移植的细胞大部分发生了凋亡，归巢到损伤部位的细胞和分化为靶细胞的数量有限，不能充分解释其组织修复现象。现在越来越多的研究认为脐带间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，直径在30-150nm，具有脂质双层膜结构。外泌体的功能取决于其来源的细胞类型，其在机体免疫应答、肿瘤生长和迁移、细胞分化、细胞通讯和组织稳态等方面发挥重要作用，在组织再生方面具有良好的临床应用前景。

有研究表明干细胞来源的外泌体与靶细胞通过膜融合或者内吞作用后将生物活性物质转运至靶细胞，介导细胞间通讯并影响靶细胞功能，还具有抑制炎症反应、免疫调节、血管生成、参与组织修复的功能。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

现在大部分研究中采用胎牛血清或血清替代物培养脐带间充质干细胞，收集上清液直接制备外泌体，并未去除血清和血替中自身携带的外泌体，因此成分不纯；有些研究或试剂盒中会加入化学试剂(聚乙二醇)或其他试剂等，可能会引入热源或污染等，也会影响后续研究和临床应用。因此如何去除血清或血清替代物自身携带的外泌体，保证脐带间充质干细胞外泌体的纯度非常重要。

目前提取外泌体的方法主要有超高速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法、色谱法等。密度梯度离心法得到的样本较纯，但是比较耗时，操作复杂，不利于大规模生产；免疫磁珠法和色谱法也存在效率低，难以大规模生产的问题；试剂盒法操作简单，但是成本比较高，分离的外泌体纯度较低。因此，研究一种高效的、利于大规模生产的、高纯度的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法对开展外泌体的科学研究和临床试验研究尤为重要。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，并确保脐带间充质干细胞外泌体的来源。本发明是以新生儿脐带为脐带间充质干细胞来源，使用去除自身携带的外泌体的胎牛血清或者血清替代物配制的培养基培养，收集上清液进一步采用差速离心法分离提取外泌体，操作简单、纯度高、适用于大规模生产。

一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法，包括如下步骤：

1)脐带间充质干细胞的培养

采集足月剖宫产新生儿脐带剪成2-3cm小段，清洗后剥出华通胶剪至1mm²小块，均匀铺于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂浓度的培养箱中培养，8-24h内加入15ml完全培养基覆盖组织块，培养至第五天半换液，此后每隔2-3天换液，细胞融合度达到70-80％时，吸出组织块加到一个新的培养瓶中，补加培养基到15ml，1-2天后观察新的细胞从组织块周围爬出，融合度达到70％-80％左右时进行传代，记为P1，持续传代操作，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代作为实验用的脐带间充质干细胞；

2)脐带间充质干细胞的鉴定