[发明专利]弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫α淀粉酶基因，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在α淀粉酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

主权项

1.一种弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)出发虫株是具有α淀粉酶基因的弓形虫虫株，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(2)pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgAMY质粒的构建：利用软件设计弓形虫α淀粉酶基因的打靶位点，根据所设计的靶点序列设计gRNA上、下游引物，然后以pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgUPRT质粒为模板，利用所设计的引物及Q5点突变试剂盒进行PCR扩增，对扩增产物进行KLD酶连接并转化DH5α感受态细胞，经提取后得到pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgAMY质粒，其中，上、下游引物序列分别为：gRNA‑AMY‑F：5’‑GTCCCAGGGCATGCTATGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC‑3’gRNA‑R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；(3)α‑amy‑5UTR::DHFR::α‑amy‑3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，分别扩增α‑amy‑5UTR和α‑amy‑3UTR同源臂，以pUC19质粒及含DHFR质粒为模板分别扩增pUC19载体、DHFR药物筛选标签，连接上述4个片段，构建重组质粒pUC19‑α‑amy‑5UTR::DHFR::α‑amy‑3UTR，该质粒即α淀粉酶基因的敲除质粒，利用α‑amy‑5UTR‑F、α‑amy‑3UTR‑R引物扩增上述基因敲除质粒即获得α‑amy‑5UTR::DHFR::α‑amy‑3UTR同源模板，其中，扩增α‑amy‑5UTR和α‑amy‑3UTR同源臂所用的上、下游引物序列分别为：U5α‑amy‑F：5’‑GTTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCGCCAGAGGTCGCAGTT‑3’U5α‑amy‑R：5’‑GATGTCTTCTGCGCGGGTTGGTTCCAGAAGTTCTGCGTC‑3’U3α‑amy‑F：5’‑GCCACAAGTTCAGCGTGTCCAGAAAGTTCTTTTCAAGTCTC‑3’U3α‑amy‑R：5’‑GCTATGACCATGATTACGCCGGTGTACAAGAGGAACATGA‑3’(4)弓形虫基因敲除虫株的获得：将步骤(2)中的pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sg AMY质粒和步骤(3)中的α‑amy‑5UTR::DHFR::α‑amy‑3UTR同源模板共电转至步骤(1)中所述出发虫株，通过1uM乙胺嘧啶筛选，PCR鉴定，获得α淀粉酶基因敲除虫株，所述基因敲除虫株缺失SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。