[发明专利]弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫α淀粉酶基因，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在α淀粉酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

技术领域

本发明涉及一种弓形虫α淀粉酶(简称AMY)基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的α淀粉酶基因缺失虫株的用途，属于生物及基因工程领域。

背景技术

弓形虫是一种能够引起世界性的人畜共患病的原虫，从属于顶复动物门，是一种专性细胞内寄生虫，具有很强的入侵能力，能够感染几乎所有温血动物。据估计，世界上超过三分之一的人口已经暴露在这种寄生虫之下，并已被该虫潜伏感染。在南美和欧洲一些地区，人群和动物的感染率高达80-90％；在中国，感染率一般在10％左右。弓形虫是一种非常重要的机会性致病原虫，在人类中，免疫功能正常的宿主感染后多呈无症状带虫状态，而在免疫功能受损或先天感染者，常存在很大风险，严重时可致死。孕妇感染弓形虫可引起流产、胎儿畸形、死胎，免疫缺陷和免疫抑制病。鉴于其危害的严重性，弓形虫已被列为孕妇常规检查中的一个必检项目。弓形虫能在人、畜和野生动物之间广泛传播，对人类健康和畜牧业生产构成严重威胁，弓形虫感染重要农业动物会产生巨大经济损失，同时能通过食物传播给人类。随着城市犬、猫的数量增多，人们饮食习惯及行为方式的改变，以及有机农业的兴起，目前弓形虫感染率正呈上升的趋势。

因此，弓形虫病的防控对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要意义。然而，到目前为止，弓形虫病的预防没有良好的疫苗，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了α淀粉酶基因，具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

(1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(简称△AMY虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒、制备α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经1uM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△AMY；

(2)进行了基因敲除虫株△AMY毒力试验：以野生型虫株ME49为对照,腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×10²个速殖子/小鼠，每组接10只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△AMY敲除株的小鼠30天内存活率90％。

(3)不同剂量的△AMY虫株对小鼠的毒力试验：腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×10²，1×10³，和1×10⁴个敲除株虫子，每组接10只，对照组接1×10²个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种1×10²敲除株实验组小鼠30天之内没有死亡，1×10³敲除株30天之内小鼠存活率80％，1×10⁴敲除株30天之内小鼠存活率50％，对照组小鼠存活率20％。说明弓形虫AMY基因敲除之后对小鼠的毒力下降明显。

(4)小鼠感染△AMY虫株后的荷虫量试验：对7周龄雌性ICR小鼠腹腔接种1×10⁵个敲除株和野生型虫株速殖子，感染后7天，收取小鼠腹水，进行定量qPCR，分析腹水荷虫量。结果表明接种△AMY敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△AMY在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。