[发明专利]DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用

摘要

本申请提供一种基于DNA碳点‑硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，该方法包括DNA碳点‑硅纳米水凝胶的制备和DNA碳点‑硅纳米水凝胶荧光检测癌胚抗原，DNA碳点‑硅纳米水凝胶的制备包括荧光碳点的制备、SiNPs‑CD‑DNA的制备、DNA与甲基丙烯酸的结合、聚甲基丙烯酸(MAA)‑DNA复合物的合成、DNA碳点‑硅纳米水凝胶的合成。本申请构建的DNA碳点‑硅纳米水凝胶所需反应条件简便，构造时间短，而且利用其检测血清中的CEA，具有检测范围宽、检测灵敏度高、检测选择性好的优点，能更加准确的检测出血清样本中的CEA含量，为肿瘤病人病灶的早期诊断提供帮助。

主权项

1.一种基于DNA碳点‑硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)DNA碳点‑硅纳米水凝胶的制备(1)荧光碳点的制备S1、称取0.6g尿素和0.3g柠檬酸于烧杯中，加10mL去离子水使粉末完全溶解，在800W微波加热4min，放入60℃的真空干燥箱干燥1h。称取干粉质量。将黑色粉末放入40mL去离子水中，3000rpm离心20min，去除滤渣，收集上清液，即碳点原液；(2)SiNPs‑CD‑DNA的制备S2、取20μL上述反应清液，稀释至500μL，在12500rpm离心20min，收集上清液，即碳点基液，备用；S3、在上述碳点基液中，加入20μL 10^‑5M的引发DNA链和2mg EDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液一；同时，取5.5mg NHS(N‑羟基琥珀酰亚胺)加入表面氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒溶液中，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液二，将两份溶液混合，室温条件下于摇床中混匀反应2h后，放入4℃冰箱中继续反应12h，即得二氧化硅纳米颗粒‑碳点‑引发DNA链复合物(SiNPs‑CD‑DNA)；(3)DNA与甲基丙烯酸的结合S4、取20μL 10^‑5M的包含CEA适体结构的DNA(H_A)与10μL 0.55mg/mL的NHS溶液混合，混匀后活化30min，即得H_A活化液。同时，将17μL 2×10^‑10M的甲基丙烯酸溶液与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，即得甲基丙烯酸活化液一。室温条件下，将H_A活化液和甲基丙烯酸活化液一于室温下混合，放入摇床，在室温条件下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸‑DNA₁复合物(P_A)；S5、取20μL 10^‑5M的DNA(H_B)与10μL 0.55mg/mL的NHS混合，混匀后反应活化30min，既得H_B活化液。同时，将17μL 2×10^‑8M的甲基丙烯酸与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，既得甲基丙烯酸活化液二。室温条件下，将H_B活化液和甲基丙烯酸活化液二混合，放入摇床，于室温下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸‑DNA₂复合物(P_B)；(4)聚甲基丙烯酸‑DNA复合物的合成S6、将步骤(3)得到的甲基丙烯酸‑DNA₁复合物(P_A)和甲基丙烯酸‑DNA₂复合物(P_B)中分别加入70μL浓度为1％的光引发剂12959，再加入57μL HEPES缓冲液，将甲基丙烯酸‑DNA₁复合物(P_A)和甲基丙烯酸‑DNA₂复合物(P_B)两份溶液放入紫外灯下光照反应19min，形成聚甲基丙烯酸‑DNA复合物；(5)DNA碳点‑硅纳米水凝胶的合成S7、将步骤(4)得到的聚甲基丙烯酸‑DNA₁复合物(P_A)和聚甲基丙烯酸‑DNA₂复合物(P_B)两份溶液放入95℃水浴中加热5min后，迅速转入0℃冰水中，使溶液温度迅速降温待用；S8、上述冷却后的两份溶液与步骤(2)产生的二氧化硅纳米颗粒‑碳点‑引发DNA链复合物(SiNPs‑CD‑DNA)溶液充分混匀，加入117μL HEPES缓冲液，室温摇床中反应12h，即形成DNA碳点‑硅纳米水凝胶；(二)血清中CEA的荧光强度检测向步骤(5)生成的DNA碳点‑硅纳米水凝胶中加入含CEA的血清，然后放入摇床反应2‑3h，最后用分子荧光仪测定其荧光强度,得到荧光强度值。