[发明专利]DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用

权利要求书

1.DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(一)DNA碳点-硅纳米水凝胶的制备

(1)荧光碳点的制备

S1、称取0.6g尿素和0.3g柠檬酸于烧杯中，加10mL去离子水使粉末完全溶解，在800W微波加热4min，放入60℃的真空干燥箱干燥1h；称取干粉质量；将黑色粉末放入40mL去离子水中，3000rpm离心20min，去除滤渣，收集上清液，即碳点原液；

(2)SiNPs-CD-DNA的制备

S2、取20μL上述碳点原液，稀释至500μL，在12500rpm离心20min，收集上清液，即碳点基液，备用；

S3、在上述碳点基液中，加入20μL 10^-5M的引发DNA链和2mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液一；同时，取5.5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入表面氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒溶液中，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液二，将两份溶液混合，室温条件下于摇床中混匀反应2h后，放入4℃冰箱中继续反应12h，即得二氧化硅纳米颗粒-碳点-引发DNA链复合物SiNPs-CD-DNA；

(3)DNA与甲基丙烯酸的结合

S4、取20μL 10^-5M的包含CEA适体结构的DNA H_A与10μL 0.55mg/mL的NHS溶液混合，混匀后活化30min，即得H_A活化液；同时，将17μL 2×10^-10M的甲基丙烯酸溶液与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，即得甲基丙烯酸活化液一；室温条件下，将H_A活化液和甲基丙烯酸活化液一于室温下混合，放入摇床，在室温条件下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸-DNA₁复合物(P_A)；

S5、取20μL 10^-5M的DNA H_B与10μL 0.55mg/mL的NHS混合，混匀后反应活化30min，既得H_B活化液；同时，将17μL 2×10^-8M的甲基丙烯酸与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，既得甲基丙烯酸活化液二；室温条件下，将H_B活化液和甲基丙烯酸活化液二混合，放入摇床，于室温下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸-DNA₂复合物(P_B)；

(4)聚甲基丙烯酸-DNA₁复合物P_A的合成和聚甲基丙烯酸-DNA₂复合物P_B的合成

S6、将步骤(3)得到的甲基丙烯酸-DNA₁复合物P_A和甲基丙烯酸-DNA₂复合物P_B中分别加入70μL浓度为1％的光引发剂12959，再加入57μL HEPES缓冲液，将甲基丙烯酸-DNA₁复合物P_A和甲基丙烯酸-DNA₂复合物P_B两份溶液放入紫外灯下光照反应19min，分别形成聚甲基丙烯酸-DNA₁复合物P_A和聚甲基丙烯酸-DNA₂复合物P_B；

(5)DNA碳点-硅纳米水凝胶的合成

S7、将步骤(4)得到的聚甲基丙烯酸-DNA₁复合物P_A和聚甲基丙烯酸-DNA₂复合物P_B两份溶液放入95℃水浴中加热5min后，迅速转入0℃冰水中，使溶液温度迅速降温待用；

S8、将冷却后的上述两份溶液与步骤(2)产生的二氧化硅纳米颗粒-碳点-引发DNA链复合物SiNPs-CD-DNA溶液充分混匀，加入117μL HEPES缓冲液，室温摇床中反应12h，即形成DNA碳点-硅纳米水凝胶；

(二)血清中CEA的荧光强度检测

向步骤(5)生成的DNA碳点-硅纳米水凝胶中加入含CEA的血清，然后放入摇床反应2-3h，最后用分子荧光仪测定其荧光强度,得到荧光强度值；

DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用所述步骤(2)二氧化硅纳米颗粒、碳点和引发DNA链的结合中，引发DNA链序列为TTT TTT AGC TGAACG ATA CCA,所述引发DNA链5′端修饰羧基；

DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用所述步骤(3)DNA与甲基丙烯酸的结合中，具有CEA适体结构的DNA H_A结构序列为TTT TTT CCA CGATAC CAG CTT ATT CAA TTC GTG GGA TGT CTG GTA TCG TTC AGC T，所述含CEA适体结构的DNA H_A链3′端修饰氨基，5′端修饰亚甲基蓝；

DNA碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用所述步骤(3)DNA与甲基丙烯酸的结合中，所述DNA H_B结构序列为CCA CGA ATT GAA CAA GAG CTGAAC GAT ACC ACT ATT GCT TAT TCA ATA TTT TT,所述DNA H_B 5′端修饰氨基。