[发明专利]检测血液中帕罗西汀药物含量液相色谱分析方法

摘要

本发明采用液相色谱分析方法检测血液样本中帕罗西汀的血药浓度含量，该检测方法利用高效液相色谱仪和荧光检测器对标准溶液进行标定，分别拟合得出代表帕罗西汀浓度的标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，对该待检测血液样品经过前处理后，使用相同的高效液相色谱仪和荧光检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液样品的y代入上述标准曲线方程中，通过计算分别得到待测血液样品中帕罗西汀的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，通过计算可以得到待检测血液样品中的帕罗西汀的浓度，本发明为帕罗西汀的给药提供实验基础。

主权项

1.一种检测血液样品中帕罗西汀血药浓度的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定(a)标准工作液的配制：精确称取帕罗西汀标准品10mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液A，将标准储备液A用含40‑60％甲醇的水溶液进行稀释，分别在含有160‑5400ng/mL帕罗西汀的浓度范围内配置出各标准工作液，并在‑80℃条件下保存；(b)内标工作液的配制：精确称取维拉帕米标准品5mg于5mL容量瓶，用甲醇溶解，并定容至5mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含40‑60％甲醇的水溶液进行稀释，得到含有浓度为5μg/mL维拉帕米的内标工作液，并在‑80℃条件下保存；(c)用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液器分别移取至少三种不同浓度标准工作液10μL，将上述至少三种不同浓度标准工作液分别与10μL内标工作液和190μL空白血清或血浆混合制成至少三种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀2‑4min后，再分别加入含有2‑5％的三氯乙酸水溶液200μL，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀5‑7min后，加入含有0.8‑1.2mol/L氢氧化钠水溶液200μL，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀5‑7min后，加入1000μL正己烷萃取剂，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀13‑17min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心8‑12min，得到上清液，分别移取800μL的上述上清液并置于另一个离心管中，在常温下用N₂缓慢吹干；向上述吹干的离心管中分别加入100μL含有35‑55％的乙腈水溶液的复溶液，进行溶解，然后在1500‑2000rpm转速下涡旋混匀2‑4min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心4‑6min，得到上清液，分别移取上述上清液，利用高效液相色谱仪和荧光检测器对上述上清液进行检测，得到至少三种不同浓度的帕罗西汀和维拉帕米的标准溶液色谱图，从上述色谱图中分别得到帕罗西汀和维拉帕米的峰面积，分别以上述至少三个不同浓度的帕罗西汀峰面积与维拉帕米峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准工作液中的帕罗西汀浓度与内标工作液中维拉帕米浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x，将所得到的至少三组x和y数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；(二)检测血液的离心取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(d)用移液枪移取10μL步骤(b)的内标工作液于2.0mL的离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀2‑4min后，加入含有2‑5％的三氯乙酸水溶液200μL，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀5‑7min后，加入含有0.8‑1.2mol/L氢氧化钠水溶液200μL，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀5‑7min后，加入1000μL正己烷萃取剂，并在转速为1500‑2000rpm下涡旋混匀13‑17min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心8‑12min后，得到上清液；(e)取步骤(d)上清液800μL放入另一支1.5mL离心管中，在常温下用N₂缓慢吹干；(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL含有35‑55％乙腈水溶液的复溶液，然后在1500‑2000rpm转速下涡旋混匀2‑4min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心4‑6min，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测使用高效液相色谱仪和荧光检测器对上述步骤(f)待测样品进行检测，得到上述待测样品中帕罗西汀和维拉帕米的色谱图，从上述色谱图中得到帕罗西汀峰面积与维拉帕米峰面积，将帕罗西汀峰面积与维拉帕米峰面积的比值y代入上述步骤(c)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中帕罗西汀与维拉帕米的相对浓度x，在内标工作液中维拉帕米浓度是已知的，由此计算得出该待检测血液样本中的帕罗西汀的血药浓度。