[发明专利]可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法

摘要

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，取得适量pAAV‑GFAP‑EGFP表达质粒、pRep2/Cap6(pRC6)、pRC8和pHelper进行AAV病毒的生产，取得适量的AAV病毒进行梯度离心纯化，转染得到AAV载体，转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物A，进行纯化病毒载体完整性验证，分析EGFP表达的细胞特异性，评估载体注射后SGC转导的比率，得到结果。本发明成功构建含有GFAP启动子的AAV载体，AAV载体因安全性较高已经被美国FDA批准可供人体内使用，该载体能特异性在DRG内转染SGCs，为后续基因治疗创造了条件，提高了安全性，促进神经性疼痛的治疗手段的进步，减轻了患者的负担。

主权项

1.可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取得适量pAAV‑GFAP‑EGFP表达质粒、pRep2/Cap6(pRC6)、pRC8和pHelper进行AAV病毒的生产，准备足量的裂解缓冲液(50mM Tris‑HCl，150mM NaCl，2mM MgCl 2，pH8.0)、100U/ml的benzonase(Sigma‑Aldrich)、含有2.5N NaCl的40％PEG8000(Sigma‑Aldrich)的储存溶液、含有1mM CaCl 2和2mM KCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、40ml Quick‑Seal离心管、18号针头、Centricon Plus‑20(Regenerated Cellulose 100，000MWCO，Millipore，Bill‑erica，MA)、含有5％山梨糖醇(Sigma‑Aldrich)的PBS、氨苄青霉素抗性基因、十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶(SDS‑PAGE)、Pierce银染色试剂盒(Fisher Scientific，Rockford，IL)、小鼠抗Vp1，‑2，‑3抗体(1：1000稀释；Research Diagnostic Inc.)、1％Alcian blue(Electron Microscopy Sciences)预处理铜网(400孔涂有聚醋酸甲基乙烯脂和薄碳膜；Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)、1％乙酸双氧铀(Electron Microscopy Sciences)、JEOL 2100和Hitachi 600透射电子显微镜；步骤二：取得适量的AAV病毒，采用Optirep(Sigma‑Aldrich，St Louis，MO，USA)梯度离心纯化；步骤三：通过用pRC6或pRC8和pHelper质粒将CaPO4共转染pAAV‑GFAP‑EGFP到293T细胞中来产生AAV载体；步骤四：转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris‑HCl，150mM NaCl，2mM MgCl 2，pH8.0)中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物A，将细胞裂解物A通过2500g离心30分钟澄清得到细胞裂解物B，将细胞裂解物B与100U/ml的benzonase(Sigma‑Aldrich)在37℃温育1小时得到细胞裂解物C，将含有2.5N NaCl的40％PEG8000(Sigma‑Aldrich)的储存溶液加入到细胞裂解物中至终浓度为8％，然后将溶液在冰上温育2小时，以2500g离心30分钟，并将沉淀在含有1mM CaCl 2和2mM KCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中分离；步骤五：进行纯化病毒载体完整性验证；步骤六：取2μl构建的腺相关病毒载体，通过微量注射器缓慢注射至SD大鼠DRG，注射完毕5min后缓慢撤出针头，病毒转染后5周将动物安乐死，DRG包埋切片，使用GFP抗体通过免疫荧光分析EGFP表达的细胞特异性；步骤七：AAV6‑GFAP‑EGFP成功转染后EGFP在Tubb3标记的初级感觉神经元胞体周围呈环状表达，其中EGFP信号位于Tubb3阳性的神经元细胞及NKAα1标记的神经元质膜之外，与GFAP染色高度共定位；步骤八：评估载体注射后SGC转导的比率，对围绕神经元的环形SGC行免疫组织化学检测：于注射AAV6‑GFAP‑EGFP的DRG，有70％±8％的神经元周围观察到EGFP阳性的环形SGC，而只有少数神经元胞体EGFP呈阳性(～1％)，得到本项目构建的病毒载体可特异性的在SGCs中表达的结果。