[发明专利]可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，其特征在于，取得适量pAAV‑GFAP‑EGFP表达质粒、pRep2/Cap6(pRC6)、pRC8和pHelper进行AAV病毒的生产，取得适量的AAV病毒进行梯度离心纯化，转染得到AAV载体，转染后三天，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，并通过3个循环的冻融裂解得到细胞裂解物A，进行纯化病毒载体完整性验证，分析EGFP表达的细胞特异性，评估载体注射后SGC转导的比率，得到结果。本发明成功构建含有GFAP启动子的AAV载体，AAV载体因安全性较高已经被美国FDA批准可供人体内使用，该载体能特异性在DRG内转染SGCs，为后续基因治疗创造了条件，提高了安全性，促进神经性疼痛的治疗手段的进步，减轻了患者的负担。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法。

背景技术

疼痛是困扰人类的一大顽疾，2000年被世卫组织列为第五大生命体征，73％的人一生中会出现严重的疼痛，最常见的神经病理性疼痛有椎间盘源性疼痛及神经损伤后疼痛，临床上仅腰背痛就有多达159种病因，随着老龄化的到来及交通工具日益增多，脊柱退变及损伤导致的神经病理性疼痛日益增多，且因其病因复杂，诊断标准界定困难，治疗方法不确切，误诊误治现象严重，很难得到早期、有效、规范的诊治，严重影响了临床疗效，给患者家庭及社会带来沉重负担，极大影响人民健康水平和社会发展，因此，神经病理性疼痛研究就成为前沿课题之一；

目前慢性神经病理性疼痛缺乏特异和有效的治疗，而背根神经节(DRG)作为疼痛信号传入的初级神经元与必经之路，是疼痛药物治疗及分子治疗的最合适部位，同时DRG作为治疗靶点具有非常高的安全性和耐受性，2012年美国FDA已批准开展经椎间孔入路针对DRG的疼痛相关治疗，而临床试验也发现经椎间孔入路DRG注射治疗及电刺激治疗很少出现神经损伤等并发症，具有较高的安全性；

基因疗法已经证实为一种可治疗慢性疼痛的具有潜力的新方法，在之前研究中发现使用腺相关病毒(AAV)行基因转染已经成为一种有效的方法，可以将目的基因转移到有丝分裂后的外周感觉神经元，以最小的毒性维持对神经性疼痛的长期疗效，而在去年10月，美国FDA于批准腺相关病毒(AAV)用于临床治疗，前期我们研究发现针对背根神经节神经元细胞进行AAV介导的基因转染治疗，并运用干扰肽适配体特异结合神经元表面影响疼痛传递的信号通路，并在动物试验中取得良好效果；

目前对DRG基因治疗主要针对神经元细胞，而忽略了神经节中卫星胶质细胞(SGCs)在疼痛信号传递中的作用，神经节中卫星胶质细胞(SGCs)是疼痛信号传递通路上的一个重要部分，神经损伤后的SGC增殖和活化通过多种机制影响感觉信号传递，包括基因表达的改变，增加SGCs之间和SGCs和神经元间的耦合；诱导小胶质细胞激活的趋化因子/细胞因子释放，对SGC特异性分子(诸如连接蛋白43(Cx43)、谷氨酰胺合成酶(GS)、ATP敏感型内向整流钾通道10(Kir4.1)、兴奋性氨基酸转运蛋白1(EAAT1)、嘌呤能离子型P2X7受体(P2X7R)和GFAP)的基因修饰，可以显著改变正常和神经损伤的啮齿类动物的对感觉的反应，因此，在背根神经节(DRG)中针对SGC的基因疗法可以为慢性疼痛的治疗提供新的思路，而针对DRG中SGCs的特异性转染技术在国内外尚属空白，所以现在需要设计可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计可靶向转染背根神经节卫星胶质细胞腺病毒载体构建方法，包括以下步骤：