[发明专利]采用模式识别技术识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法

摘要

本发明公开了采用模式识别技术识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，包括以下步骤：a、采集大肠杆菌；b、提取大肠杆菌中代谢物和多肽；c、Orbitrap‑MS分析检测；d、Orbitrap‑MS数据处理分析；e、使用R语言软件和自己编写的程序对数据进行模式识别分析。利用R语言软件强大的统计能力处理从高分辨率Orbitrap‑MS中获得的大量数据，对耐碳青霉烯类药物的大肠杆菌菌株和敏感的大肠杆菌菌株的质谱数据展开模式识别分析，实现对耐碳青霉烯类的大肠杆菌菌株和敏感的大肠杆菌菌株的快速、准确的识别。同时，找出在统计学上具有显著性差异的化合物，为研究耐碳青霉烯类的大肠杆菌菌株和敏感的大肠杆菌菌株的差异及阐明大肠杆菌耐药机制提供理论基础。

主权项

1.采用模式识别技术识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、采集大肠杆菌：按照要求，规范采集患者的细菌样本，采集后立即于‑80℃冷冻保存；b、提取大肠杆菌中代谢物和多肽：取‑80℃保存的菌株，用枪头进行划线，并放入生化培养箱中，孵育过夜，将培养皿中的菌体完全移入到EP管中，并向EP管中加入PBS洗涤液，用涡旋混合仪使其混合均匀，放入冷冻离心机中离心，弃上清液，重复上述实验2次；将洗涤好的菌体放入‑20℃保存，并加入尿素，混合后破碎菌体，离心，取上清；向上清液中加入丙酮，置于‑20℃，沉淀过夜；取沉淀完全的样品，离心，EP管中的上清液，即为大肠杆菌代谢物样品，沉淀即为大肠杆菌蛋白质样品；加碳酸氢铵和尿素于蛋白质样品中，溶解蛋白，离心，取上清，用BCA法测蛋白浓度。取蛋白，加入(三(2‑羧乙基)膦盐酸盐)TCEP，EP管用封口膜封紧，95℃金属浴放置5min，取出后降温至室温；用碳酸氢铵稀释10倍，加入胰蛋白酶，37℃生化培养箱中孵育过夜；向已经酶解的蛋白样品中加入甲酸，使其pH为3左右，终止酶解，‑20℃保存，待Orbitrap‑MS检测；每株大肠杆菌均设置3个生物学重复；c、Orbitrap‑MS分析检测：检测前要先用仪器校正液对仪器进行校正，取代谢物用ACN:H₂O＝1:1的0.1％的甲酸混合溶剂稀释,用进样针进样检测，其余的代谢物均用相同的方法进行处理；多肽样品检测时，仪器校正同代谢物样品一样，然后取多肽样品用ACN:H₂O＝9:1的0.1％的甲酸混合溶剂稀释,用进样针进样检测，其余的多肽样品均用相同的方法进行处理；d、Orbitrap‑MS数据处理分析：在分析前将24个多肽和24个代谢物经过筛选后得到的数据汇总在一个合并表内，并使用Excel对数据进行预处理，合并和筛选；e、使用R语言软件和自己编写的程序对数据进行模式识别分析。