[发明专利]采用模式识别技术识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法

权利要求书

1.采用模式识别技术识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、采集大肠杆菌：按照要求，规范采集患者的细菌样本，采集后立即于-80℃冷冻保存；

b、提取大肠杆菌中代谢物和多肽：取-80℃保存的菌株，用枪头进行划线，并放入生化培养箱中，孵育过夜，将培养皿中的菌体完全移入到EP管中，并向EP管中加入PBS洗涤液，用涡旋混合仪使其混合均匀，放入冷冻离心机中离心，弃上清液，重复上述实验2次；将洗涤好的菌体放入-20℃保存，并加入尿素，混合后破碎菌体，离心，取上清；向上清液中加入丙酮，置于-20℃，沉淀过夜；取沉淀完全的样品，离心，EP管中的上清液，即为大肠杆菌代谢物样品，沉淀即为大肠杆菌蛋白质样品；

加碳酸氢铵和尿素于蛋白质样品中，溶解蛋白，离心，取上清，用BCA法测蛋白浓度。取蛋白，加入(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)TCEP，EP管用封口膜封紧，95℃金属浴放置5min，取出后降温至室温；用碳酸氢铵稀释10倍，加入胰蛋白酶，37℃生化培养箱中孵育过夜；向已经酶解的蛋白样品中加入甲酸，使其pH为3左右，终止酶解，-20℃保存，待Orbitrap-MS检测；每株大肠杆菌均设置3个生物学重复；

c、Orbitrap-MS分析检测：检测前要先用仪器校正液对仪器进行校正，取代谢物用ACN:H₂O＝1:1的0.1％的甲酸混合溶剂稀释,用进样针进样检测，其余的代谢物均用相同的方法进行处理；多肽样品检测时，仪器校正同代谢物样品一样，然后取多肽样品用ACN:H₂O＝9:1的0.1％的甲酸混合溶剂稀释,用进样针进样检测，其余的多肽样品均用相同的方法进行处理；

d、Orbitrap-MS数据处理分析：在分析前将24个多肽和24个代谢物经过筛选后得到的数据汇总在一个合并表内，并使用Excel对数据进行预处理，合并和筛选；

e、使用R语言软件和自己编写的程序对数据进行模式识别分析。

2.根据权利要求1所述的识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，其特征在于：上述步骤a中采集的细菌的编号分别为：耐碳青霉烯类大肠杆菌编号为R1,R2,R3,R4,敏感大肠杆菌编号为S1，S2，S3，S4。

3.根据权利要求1所述的识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，其特征在于：上述步骤d中采用“80％规则”对数据进行筛选，删除缺失值过多的变量，删除在所有组别中(如耐药组和敏感组)中出现频率都小于80％的离子。

4.根据权利要求1所述的识别耐碳青霉烯类大肠杆菌的方法，其特征在于：上述步骤c中24个代谢物和24个多肽均在96h内检测完毕。