[发明专利]抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法，进行生物信息学预测、分析miR‑4660/miR‑6797对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点、利用细胞学水平分析miR‑4660对基因AGXT的表达、miRNAs及基因表达水平的检测:免疫组化检测、RT‑PCR实验检测。本发明从草酸代谢最重要基因AGXT的转录后调控机制入手，首次发现非编码小RNA(microRNA)hsa‑miR‑4660可以通过直接结合AGXT‑3’UTR区域抑制基因的转录和翻译，最终增加草酸结石的发生率。

主权项

1.一种MiR‑4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，所述MiR‑4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法包括：第一步，生物信息学预测：利用DIANA‑mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICRAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan的miRNAs与靶标基因结合位点预测软件对AGXT‑3’UTR的miRNAs靶标序列进行预测，并通过IBIVU server、UCSC检测结合位点保守性，分析miR‑4660和miR‑6797的结合AGXT 3‑’UTR特性；第二步，分析miR‑4660/miR‑697对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点：将AGXT‑3’UTR亚克隆至pMIR‑Report荧光素酶报告基因下游，表达融合AGXT‑3’UTR的重组荧光素酶；将报告载体分别与hsa‑miR‑4660/hsa‑miR‑6797 mimics以及随机miRNA序列共同转染Hela细胞，培养后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值变化；第三步，利用细胞学水平分析miR‑4660对基因AGXT的表达：进行RT‑PCR分析、Western blot分析；第四步，miRNAs及基因表达水平的检测:进行免疫组化检测、RT‑PCR实验检测。