[发明专利]抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及预警方法

权利要求书

1.一种MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，所述MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法包括：

第一步，生物信息学预测：利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICRAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、TargetScan的miRNAs与靶标基因结合位点预测软件对AGXT-3’UTR的miRNAs靶标序列进行预测，并通过IBIVU server、UCSC检测结合位点保守性，分析miR-4660和miR-6797的结合AGXT 3-’UTR特性；

第二步，分析miR-4660/miR-697对基因AGXT 3’UTR的影响，确定靶标位点：将AGXT-3’UTR亚克隆至pMIR-Report荧光素酶报告基因下游，表达融合AGXT-3’UTR的重组荧光素酶；将报告载体分别与hsa-miR-4660/hsa-miR-6797 mimics以及随机miRNA序列共同转染Hela细胞，培养后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值变化；

第三步，利用细胞学水平分析miR-4660对基因AGXT的表达：进行RT-PCR分析、Westernblot分析；

第四步，miRNAs及基因表达水平的检测:进行免疫组化检测、RT-PCR实验检测。

2.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，第二步中，培养48小时后，分析融合重组荧光素酶报告载体荧光值是否有变化；通过连续位点点突变的方法，获取miR-4660/miR-6797具体结合的靶标序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

3.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，RT-PCR分析的方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后，利用设计的AGXT定量引物对cDNA中AGXT的表达水平进行定量测定，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT的mRNA水平是否有变化，获得hsa-miR-4660对基因转录水平影响信息；

AGXT定量引物包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

4.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，Western blot分析方法包括：

分别将hsa-miR-4660mimics或hsa-miR-4660沉默子antagomir以及随机miRNA序列载体分别转染至L02细胞，转染48小时后，提取细胞总蛋白，检测miRNAs过表达或者干扰miRNAs表达后，AGXT蛋白水平差异，获得hsa-miR-4660对基因翻译水平影响信息。

5.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，免疫组化分析方法包括：

对需要进行肝脏穿刺活检的肝脏组织，定制AGXT及hsa-miR-4660特异性探针，石蜡包埋组织后切片染色，分析AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。

6.如权利要求1所述的MiR-4660抑制AGXT基因表达引起草酸性结石的分子机制及早期预警方法，其特征在于，RT-PCR实验方法包括：

提取草酸结石组和正常对照组外周血标本总RNA，利用miR-4660特异性逆转录引物逆转录并检测miR-4660的表达，分析草酸结石组与正常对照组外周血中AGXT及hsa-miR-4660表达水平的差异。