[发明专利]大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体是大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用，所述大豆脂肪酸脱饱和酶基因家族多基因CRISPR/Cas9载体使用经体外活性检测＞90％的gRNA，gRNA序列如G1RNAF/G1RNAR、G2RNAF/G2RNAR、G3RNAF/G3RNAR、G4RNAF/G4RNAR、G5RNAF/G5RNAR所示，合成引物gRNA‑F/gRNA‑R，以标准gRNA片段为模板做PCR，同时使用标准gRNA1引物g1‑FP和gRNA‑RP或者标准gRNA2引物g2‑FP和gRNA‑RP引物对，本发明利用CRISPR/Cas9技术，对大豆脂肪酸脱饱和酶GmFAD2基因从反向遗传学方向进行了研究，表明负向调控GmFAD2基因能够影响大豆种子的含油量，通过分子生物学的手段，获得了稳定的高油酸纯合突变体材料，为大豆高油酸育种提供了理论基础和新的种质资源。

主权项

1.大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体，其特征在于，以大豆脂肪酸脱饱和酶基因家族多基因的gDNA序列设计靶点，合成引物gRNA‑F/gRNA‑R，以标准gRNA片段为模板做PCR，大豆脂肪酸脱饱和酶基因家族多基因CRISPR/Cas9载体使用经体外活性检测＞90％的gRNA，gRNA序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示，合成引物gRNA‑F/gRNA‑R，以标准gRNA片段为模板做PCR，同时使用标准gRNA1引物g1‑FP和gRNA‑RP或者标准gRNA2引物g2‑FP和gRNA‑RP引物对，以标准gRNA片段为模板做PCR，PCR产物120bp，作为后续体外转录的DNA模板，大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体的构建方法为：(1)使用经体外活性检测＞90％的gRNA合成Oligo序列，G1RNAF/G1RNAR～G5RNAF/G5RNAR，将合成的Oligo加水溶解至10μM，(2)按照下列反应体系制备Oligo二聚体：Buffer Anneal：18μL，UP Oligo：1μL，LOW Oligo：1μL，Total：20μL，混合后，95℃加热3分钟，然后以0.2℃/秒缓慢降至20℃；(3)将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体，反应体系如下：H₂O：6μL，CRISPR/Cas Vector:2μL，Oligo二聚体：1μL，Enzyme Mix：1μL，Total:10μL，混匀后反应1h，(4)取出5μL反应液加到大肠杆菌感受态细胞内，混匀后冰浴静止30min，期间严格保持静止，轻轻取出，42℃热击60s，立即置于冰上2min，加入800μL LB液体培养基，37℃145rpm培养1h，(5)离心后吸出涂布在含有卡那霉素的LB平板上，倒置过夜培养。