[发明专利]大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体是大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用，所述大豆脂肪酸脱饱和酶基因家族多基因CRISPR/Cas9载体使用经体外活性检测＞90％的gRNA，gRNA序列如G1RNAF/G1RNAR、G2RNAF/G2RNAR、G3RNAF/G3RNAR、G4RNAF/G4RNAR、G5RNAF/G5RNAR所示，合成引物gRNA‑F/gRNA‑R，以标准gRNA片段为模板做PCR，同时使用标准gRNA1引物g1‑FP和gRNA‑RP或者标准gRNA2引物g2‑FP和gRNA‑RP引物对，本发明利用CRISPR/Cas9技术，对大豆脂肪酸脱饱和酶GmFAD2基因从反向遗传学方向进行了研究，表明负向调控GmFAD2基因能够影响大豆种子的含油量，通过分子生物学的手段，获得了稳定的高油酸纯合突变体材料，为大豆高油酸育种提供了理论基础和新的种质资源。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用。

背景技术

我国是大豆的原产地，拥有极其丰富的种质资源，大豆是重要的粮油兼用作物，是人们日常生活中食用油的主要来源，其中含有丰富的营养，有重要的经济价值。加工出来的各种豆类产品，不仅仅蛋白的含量占有重要的比例，而且还有很多人们所需要的必须氨基酸，可以起到食用补品的作用。大豆中含有种类较多的不饱和脂肪酸，其中较为常见的有油酸18％-22％，亚油酸52％-55％，亚麻酸7％-10％，有90％以上可以被人体所吸收和利用，所以，大豆油是一种优质的食用油。但在大豆油脂特别是以高油酸为育种目标的大豆品种与国际相比进展却很缓慢。人们对我国大豆种质资源进行了脂肪酸组分含量及品质性状的相关性分析，认为发现来源不同地区的大豆种质平均油酸含量差异明显，春大豆的油酸含量高于夏大豆和秋大豆；研究认为，我国不同生态类型大豆种质的油酸含量差异大，南方春大豆平均油酸含量最高；通过对我国东北地区大豆品种脂肪酸组成与含量分析，发现目前大豆主产区的油酸含量在18.9-37.7％，与国外商业大豆品相比，目前我国大豆品种油酸含量偏低。

通过对油酸合成途径的研究，我们明确知道，在种子发育的过程中，以2碳的乙酰-CoA(acetyl-CoA)为前体，经过一系列的酶作用下，经过多种酶和蛋白质的系统参与而形成油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸成分。由油酸脱氢酶(Δ12-fatty acid desaturaseII，FAD2)负责催化油酸形成含量两个双键的亚油酸，即在油酸的脂肪链中引入一个氢键而形成顺9,12-十八碳二烯酸化合物，即亚油酸，因此FAD2是决定亚油酸合成量的关键酶，目前已克隆的大豆FAD2基因有七个，同时该酶的活性也直接影响油酸成分的代谢，对于油酸在籽粒中的积累有直接的效果。

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。目前，该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

然而，关于大豆高油酸合成的研究还需要进一步提高。在理论方面，对这些脂肪酸的代谢通路及其遗传基础中发挥重要作用的关键基因功能和效率还远未了解透彻；在应用方面，如何成功将这些代谢通路的关键酶高效利用，使其能在油脂合成通路协调作用，从而培育高油酸的大豆新品种，这一问题需要人们解决。在大豆性状改良的过程当中，提高大豆油酸含量一直是科学工作者所研究的重要内容，与国外大豆相比，我国大豆品种油酸含量普遍偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供大豆脂肪酸脱饱和酶多基因CRISPR/Cas9载体构建及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：