[发明专利]一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺

摘要

本发明公开了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：(1)浸润片状载体；(2)接种并培养贴壁细胞；(3)消化细胞，对片状载体袋内的细胞进行1‑15次短时消化：(3.1)第一次消化；(3.2)多次消化；(4)转移。本发明能将片状载体上的细胞消化，并放大培养；细胞消化后分离简单，直接放出消化好的细胞悬液即可；同时采用1‑15次短时消化片状载体上的细胞，解决细胞内外表面消化时间不同步的问题，可以收获更多的细胞和保持收获的细胞有较高的活性。

主权项

1.一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)浸润片状载体：将10％DMEM加入至片状载体袋并使其达到工作体积，通5％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在10h以上，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°；(2)接种并培养贴壁细胞:(2.1)接种细胞浓度1‑9E+5个/ml；(2.2)接种参数：温度37℃，摇摆速度2‑55rpm，摇床角度2‑15°，5％CO2的混合气体；(2.3)混匀：向步骤(1)中平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将片状载体袋置于摇床上，同时通5％CO2的混合气体后，混匀2‑100分钟；摇床设置：摇摆转速2‑55rpm，温度37℃，摇床角度2‑15°；(2.4)细胞贴壁：混匀后静置培养0.1‑2h观察袋内液体澄清；(2.5)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通5％CO2的混合气体；自第二天开始，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1g/L以上；(3)消化细胞当细胞生长到一定天数，日糖耗在2‑10g/L时，对片状载体袋内的细胞进行1‑15次短时消化：(3.1)第一次消化：加入PBS清洗2次后，以浸润片状载体为标准向片状载体袋内加入0.01‑0.5％的胰酶，消化1‑60min后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率；(3.2)多次消化：以浸润载体为标准向(3.1)中消化后的片状载体袋内加入0.01‑0.5％的胰酶，消化1‑60分钟后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率，多次重复本实验步骤；(4)转移：将步骤(3)消化后细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总细胞数；将细胞悬液以一定细胞的密度接种到已提前平衡过夜的5‑15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中，或者将细胞悬液和片状载体一起放大接种到5‑15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中。