[发明专利]一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺

说明书

本发明公开了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：(1)浸润片状载体；(2)接种并培养贴壁细胞；(3)消化细胞，对片状载体袋内的细胞进行1‑15次短时消化：(3.1)第一次消化；(3.2)多次消化；(4)转移。本发明能将片状载体上的细胞消化，并放大培养；细胞消化后分离简单，直接放出消化好的细胞悬液即可；同时采用1‑15次短时消化片状载体上的细胞，解决细胞内外表面消化时间不同步的问题，可以收获更多的细胞和保持收获的细胞有较高的活性。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体的说是涉及一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺。

背景技术

片状载体培养细胞的工艺，发展至今，已非常成熟。但片状载体培养细胞有非常大的局限性。不能连续放大培养。主要原因在于片状载体消化困难。

微载体培养细胞的工艺，发展至今，也已经非常成熟。相对于片状载体消化困难，在这方面有它独到的优势。但消化后，细胞和微载体的分离，也是相当困难。不配备相应的分离设备，根本无法分离。

市场上产品消化转移放大能力有限，且污染风险较高。如方瓶转瓶，细胞工厂。而市场上类似产品微载体的消化转移放大过程中，细胞和微载体难以分开。目前市场上无片状载体消化转移放大的工艺。由于片状载体是一种提供3D结构表面积的介质，导致细胞消化时，载体内部和外部细胞消化的时间不同步。同时片状载体的3D结构，使得消化后的细胞难以掉落和分散均匀。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：

(1)浸润片状载体：将10％DMEM加入到片状载体袋并使其达到工作体积，通5％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在10h以上，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°；

(2)接种并培养贴壁细胞：

(2.1)接种细胞浓度1-9E+5个/ml；

(2.2)接种参数：温度37℃，摇摆速度2-55rpm，摇床角度2-15°，5％CO2的混合气体；

(2.3)混匀：向步骤(1)中平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将片状载体袋置于摇床上，同时通5％CO2的混合气体后，混匀2-100分钟；摇床设置：摇摆转速2-55rpm，温度37℃，摇床角度2-15°；

(2.4)细胞贴壁：混匀后静置培养0.1-2h观察袋内液体澄清；

(2.5)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通5％CO2的混合气体；自第二天开始，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1.0g/L以上；

(3)消化细胞

当细胞生长到一定天数，日糖耗在2-10g/L时，对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化：

(3.1)第一次消化：加入PBS清洗2次后，以浸润片状载体为标准向片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60min后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率；