[发明专利]一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv-ΔgC及其构建方法

摘要

本发明公开了一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv‑ΔgC及其构建方法。本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPKan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经过细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在鸭瘟病毒基因组上残留MiniF元件的问题，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

主权项

1.一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv‑ΔgC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pKD4质粒为扩增模板，构建△gC扩kana上游引物和构建△gC扩kana下游引物，通过PCR方法扩增包含两侧带有gC基因同源臂及FRT序列的kana抗性基因片段，切胶回收，获得DPV gC左臂‑FRT‑kana‑FRT‑gC右臂片段；(2)诱导含有pKD46和DPV CHv‑BAC‑G克隆菌DH10B RED重组系统表达；并制备含有pKD46和DPV CHv‑BAC‑G的DH10B阳性克隆菌感受态；电转化切胶回收DPV gC左臂‑FRT‑kana‑FRT‑gC右臂打靶片段进入含有pKD46和感染性克隆质粒的感受态中；筛选阳性克隆子，利用gC基因鉴定引物gC‑R；gC‑F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC‑kana；(3)去除阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC‑kana中的kana抗性基因，利用gC基因鉴定引物gC‑R；gC‑F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC；(4)提取重组DPV CHv‑BAC‑G△gC质粒，将其电转化进入GS1783感受态中，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC，并制备GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC感受态；(5)以pEPKan‑S为模板，GS1783‑MiniF‑F和GS1783‑MiniF‑R为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI‑Kana‑MiniF，切胶回收获得I_SceI‑Kana‑MiniF片段；(6)以CHv基因组为模板，CHv‑UL23‑F和CHv‑UL23‑R为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI‑Kana‑MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收，获得UL23‑MiniF片段；(7)以I_SceI‑Kana‑MiniF片段和UL23‑MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783‑MiniF‑F和CHv‑UL23‑R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段；(8)将I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段转化到GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23‑Kana；(9)将阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23；(10)从阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23中提取DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23质粒，用DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得去除MiniF元件的DPV CHv‑△gC。