[发明专利]一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv-ΔgC及其构建方法

权利要求书

1.一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv-ΔgC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以pKD4质粒为扩增模板，构建△gC扩kana上游引物和构建△gC扩kana下游引物，通过PCR方法扩增包含两侧带有gC基因同源臂及FRT序列的kana抗性基因片段，切胶回收，获得DPV gC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂片段；

(2)诱导含有pKD46和DPV CHv-BAC-G克隆菌DH10B RED重组系统表达；并制备含有pKD46和DPV CHv-BAC-G的DH10B阳性克隆菌感受态；电转化切胶回收DPV gC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂打靶片段进入含有pKD46和感染性克隆质粒的感受态中；筛选阳性克隆子，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv-BAC-G△gC-kana；

(3)去除阳性克隆子DPV CHv-BAC-G△gC-kana中的kana抗性基因，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv-BAC-G△gC；

(4)提取重组DPV CHv-BAC-G△gC质粒，将其电转化进入GS1783感受态中，获得阳性克隆子GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC，并制备GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC感受态；

(5)以pEPKan-S为模板，GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；

(6)以CHv基因组为模板，CHv-UL23-F和CHv-UL23-R为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收，获得UL23-MiniF片段；

(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；

(8)将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC-UL23-Kana；

(9)将阳性克隆子GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC-UL23；

(10)从阳性克隆子GS1783-DPV CHv-BAC-G△gC-UL23中提取DPV CHv-BAC-G△gC-UL23质粒，用DPV CHv-BAC-G△gC-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得去除MiniF元件的DPV CHv-△gC。

2.根据权利要求1中所述鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv-ΔgC的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增体系为：ddH₂O 14μL、Max DNAPolymerase 20μL、上游引物2μL、下游引物2μL、模板2μL；

PCR扩增条件为：98℃预变性1min、94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。