[发明专利]一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗

摘要

本发明公开一种CV‑A6病毒毒种及其人用灭活疫苗；毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217，所制成的人用CV‑A6灭活疫苗的组成为：CV‑A6灭活纯化抗原100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml。经动物实验该疫苗制品具有良好的免疫原和安全性。

主权项

1.一种CV‑A6病毒毒种，其特征在于，所述毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217；所述CV‑A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤：（1）分离CV‑A6病毒株取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水，悬浮3000xg离心30min，上清液经无菌过滤后，接种于RD细胞，3‑5天病变后，继续在RD细胞传代3代，并经RT‑PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列，该病毒株的基因型与目前中国流行株的CV‑A6的基因型一致；（2）毒株病毒在KMB17细胞上的适应挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞，弃旧培养液，用PBS溶液清洗细胞表面，加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×105细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将步骤（1）所得CV‑A10病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况，病毒达90%收获病毒，冻存备用；（3）病毒毒株的克隆纯化在KMB17细胞上已适应传代到第5代次的CV‑A6病毒收获液，用病毒稀释液稀释至10‑3、10‑4、10‑5三个稀释度，接种于已形成单层的KMB17细胞六孔培养板，37℃吸附1小时，加入不含小牛血清的病毒维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖‑MEM，待琼脂固化后，倒置于37℃培养，3天后于镜下观察蚀斑，用枪头吸取出蚀斑，置于1.5ml离心管，加入0.5mlMEM 维持液，漩涡振荡，随即接种于单层KMB17细胞，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，同样方法再进行两次蚀斑纯化，获得经鉴定为CV‑A6的纯化克隆株；所述纯化克隆株在KMB17细胞中传4代后即作为原始种子，继续传3代即作为主种子，随后再传3代即为工作种子；此原始种子、主种子和工作种子即为CV‑A6病毒毒种；（4）对步骤（3）所得原始种子、主种子和工作种子的毒种分别进行鉴定，表明所述毒种均具有良好的免疫原性、遗传稳定性和在KMB17细胞上良好适应增殖能力。