[发明专利]一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗

说明书

本发明公开一种CV‑A6病毒毒种及其人用灭活疫苗；毒种的分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217，所制成的人用CV‑A6灭活疫苗的组成为：CV‑A6灭活纯化抗原100μg/ml，氢氧化铝1mg/ml。经动物实验该疫苗制品具有良好的免疫原和安全性。

技术领域

本发明涉及一种CV-A6病毒毒种及其人用灭活疫苗。

背景技术

手足口病（hand foot mouth disease, HFMD）在全球，尤其是亚太地区，流行规模和威胁影响日益增加，而且值得注意的是，这个疾病对儿童群体的危害日益加重的过程。迄今为止，在我国的流行病学统计表明，该病自2008年被列为丙类传染病以来，已经于2009年即成为丙类传染病发病人数之首，总体病死率约为0.05%。该传染病的防控，尤其在儿童群体中的防控，已成为一个重要的公共卫生问题。

近年来CV-A6（柯萨奇病毒A组6型）感染引起HFMD爆发或流行的趋势不断增加，有些地区已成为除肠道病毒71型（EV-A71）和CV-A16以外的主要HFMD的病原体，并且与多种其它肠道病毒包括EV-A71与CV-A16出现交替循环、混合感染的现象。这凸显了控制HFMD流行的艰巨性。

目前国内外除EV-A71疫苗外，尚无其它的特效药物治疗HFMD，而疫苗是其主要预防手段。自2008年我国HFMD大流行后，HFMD已成为我国严重的的疾病负担，疫苗成为控制疾病的急需品种，历经七年的研发工作后，EV71疫苗获得批准用于手足口病的防治。为解决EV71疫苗难以控制CV-A16及CV-A6等其它肠道病毒引起HFMD的流行，以及可能由此引发的EV-A71疫苗公众接受和质疑问题，提出研发以EV-A71、CV-A16为核心，增加CV-A6等肠道病毒为主要成分的联合HFMD疫苗的必要性。目前CV-A16疫苗正在研发中，对CV-A6疫苗的研发尚缺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上所述缺陷，提供一种CV-A6病毒毒种及其筛选方法，以及以CV-A6病毒毒种制备的安全有效的人用CV-A6灭活疫苗。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述CV-A6病毒毒种，其分类命名为柯萨奇病毒A组6型，保藏编号为CGMCC No.16217, 该病毒毒种取名为YNKA1205；所述CV-A6病毒的毒种的制备方法包括以下步骤：

（1）分离CV-A6病毒株

取手足口病重症儿童病人粪便1g加5ml生理盐水，悬浮3000xg离心30min，上清液经无菌过滤后，接种于RD细胞（即人恶性胚胎横纹肌瘤细胞），3-5天病变后，继续在RD细胞传代3代，并经RT-PCR和测序获得该病毒全基因组序列及推测的氨基酸序列，该病毒株的基因型为D3，与目前中国流行株的CV-A6的基因型一致；

（2）毒株病毒在KMB17细胞上的适应

挑选已长成致密单层的P28代KMB17细胞，弃旧培养液（指MEM），用PBS溶液清洗细胞表面，加入0.125% 胰蛋白酶消化细胞，待轻拍细胞瓶，细胞从瓶壁流沙样滑下，加入细胞培养液，按2×10⁵细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将步骤（1）所得CV-A6病毒200μl接种于细胞面，37℃吸附1小时，随后加入不含小牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变情况，病毒达90%收获病毒，冻存备用；

（3）病毒毒株的克隆纯化