[发明专利]一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗

摘要

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗，采用如下步骤制备：步骤1：构建PRV‑gD基因mRNA克隆质粒和真核质粒；步骤2：伪狂犬病毒增殖与细胞培养；步骤3：抽提伪狂犬病毒DNA；步骤4：设计特异性引物：步骤5：PCR扩增伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因；步骤6：回收后目的片段与pMD19‑T载体连接；步骤7：DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备以及连接产物的转化；其构建了伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因真核表达载体PVAX‑gD，可以刺激机体产生免疫反应并产生特异性抗体和中和抗体，与空白对照有显著的差异；攻毒保护试验表明，真核表达载体具有良好的免疫原性。

主权项

1.一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗，其特征在于：采用如下步骤制备：步骤1：构建PRV‑gD基因mRNA克隆质粒和真核质粒；(1)质粒：pMD19‑T线性化质粒；(2)毒株及细胞：伪狂犬病毒XJ株，BHK21细胞、Vero细胞；步骤2：伪狂犬病毒增殖与细胞培养；步骤3：抽提伪狂犬病毒DNA；步骤4：设计特异性引物：P1：cccggatccggccccaggttcccatacactcaP2：cccctcgagctacggaccgggctgcgctttP3：P4：cccctcgagtttggatccctacggaccgggctgcgcttt上游单划线部分为限制性酶切位点BamHI，下游单划线部分为限制性酶切位点XhoI，双划线部分为T7启动子；扩增片段为分别为1286bp和1305bp；步骤5：PCR扩增伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因；(1)用抽提的PRV‑XJ株病毒DNA作为模板；(2)加入P3、P4特异性引物；(3)扩增囊膜糖蛋白gD基因；PCR扩增产物的电泳鉴定以及电泳鉴定；步骤6：回收后目的片段与pMD19‑T载体连接；将琼脂糖凝胶回收的PCR产物与pMD19‑T载体相连接，连接体系总体积10μl，16℃过夜连接；步骤7：DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备以及连接产物的转化；步骤8：转化菌落的鉴定：(1)从转化氨苄青霉素琼脂LB平板上挑取多个转化子接种于6ml氨苄青霉素液体LB培养基中，37℃，剧烈震荡过夜培育；(2)按照赛默飞世尔小量质粒抽提试剂盒的说明进行操作；(3)将抽提备用的克隆载体命名为pMD19‑gD，用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，37℃反应5‑20min；酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，成像鉴定；步骤9：核苷酸片段测序分析与鉴定：将全质粒以通用引物的方式送擎科生物有限公司进行测序，测序结果用Snap‑gene生物学软件和Blast对比分析；步骤10：真核表达载体的构建：(1)用抽提的PRV‑XJ株病毒DNA作为模板；(2)加入P1、P2特异性引物，扩增囊膜糖蛋白gD基因；(3)PCR扩增产物电泳鉴定后进行琼脂糖凝胶回收，再进行线性PCR产物的双酶切；(4)两个酶切体系均为37℃，5‑20min反应时间，在0.8％琼脂糖凝胶进行电泳后再凝胶成像系统中观察。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行操作。酶切回收的PCR产物与PVAX酶切回收产物的定向连接。连接总体积15μl，混匀后16℃过夜；(5)将连接产物转化到感受态细胞中培养保存，筛选阳性质粒后，用BamHI和XhoI双酶切重组质粒，后测序鉴定，质粒命名为PVAX‑gD；步骤11：疫苗与小鼠：(1)伪狂犬病毒基因工程缺失疫苗SA215疫苗；(2)BALB/c SPF小鼠；步骤12：溶液备存：(1)30％聚丙烯酰胺溶液；(2)5*PAGE缓冲液；(3)2*SDS上样缓冲液转印缓冲液；(4)TBST洗脱液；封闭缓冲液/抗体稀释液；(5)ECL化学发光显色液；步骤13：质粒抽提；步骤14：体外转录：(1)将无内毒素抽提的pMD19‑gD克隆质粒进行双酶切，后回收得到线性化无内毒素片段；(2)混匀后加入4μl E‑PAP轻柔混匀37℃反应45min。(3)获得具有活性的mRNA片段；步骤15：转染：将获得的mRNA和PVAX‑gD转染BHK21细胞，参考lipofectamine 3000和LipofectamineTMMessengerMAX说明进行操作。步骤16：样品制备：(1)在转染细胞24‑48h后收集细胞，制备SDS‑PAGE样品；(2)按照《分子克隆实验指南》第四版中介绍的实验方法，使用垂直立式电泳槽进行SDS‑PAGE电泳进行操作；(3)样品先经12％浓度的SDS‑PAGE电泳，电泳分离后，转印至PVDF膜，进行Western blot实验；(4)病毒半数组织培养感染剂量(TCID50)的测定；(5)中和抗体检测：使用固定病毒‑血清稀释法进行实验测定；按照Reed‑Muench方法计算中和抗体滴度及数值；(6)病毒半数致死量LD50的测定：接种病毒后每天观察记录小鼠临床症状和死亡情况，连续观察15d后，按照Reed‑Muench方法计算LD50；步骤17：mRNA包被。