[发明专利]一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗

说明书

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗，采用如下步骤制备：步骤1：构建PRV‑gD基因mRNA克隆质粒和真核质粒；步骤2：伪狂犬病毒增殖与细胞培养；步骤3：抽提伪狂犬病毒DNA；步骤4：设计特异性引物：步骤5：PCR扩增伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因；步骤6：回收后目的片段与pMD19‑T载体连接；步骤7：DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备以及连接产物的转化；其构建了伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因真核表达载体PVAX‑gD，可以刺激机体产生免疫反应并产生特异性抗体和中和抗体，与空白对照有显著的差异；攻毒保护试验表明，真核表达载体具有良好的免疫原性。

【技术领域】

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗。

【背景技术】

伪狂犬病是由伪狂犬病毒也称为猪1型疱疹病毒引起的一种猪为唯一自然宿主，也可以感染多种家畜(牛、羊、犬等)、家禽(鸡、火鸡等)和野生动物的急性传染病。猪作为唯一自然宿主长期贮存病毒并排毒，引起成年猪呼吸道症状、高热，怀孕母猪严重并发症致流产、死胎和木乃伊胎，断奶仔猪中枢神经症状明显且发病率和死亡率很高。在其他动物体上以发热、奇痒及脑脊髓炎主要症状。以往的研究认为伪狂犬病毒不会感染高等灵长类动物，但是现已在中国上海报道发现第一例人类感染伪狂犬病毒且表现出了类似于人类疱疹病毒症状造成眼角膜炎症损伤和眼部结构坏死，且在人群的酶联免疫吸附测定中也有发现血清样品为阳性。

近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。猪伪狂犬病是当今危害养猪业最重要的传染病之一，疫苗免疫仍是防控伪狂犬病的最主要方式。然而2012年起，伪狂犬病毒变异株在全国多地流行，造成了养猪业的巨大经济损失。本研究以囊膜糖蛋白gD其分子和功能特性为基础，创新地研究PRV囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗作为候选疫苗对PRV的防治有着重要的潜在价值。猪伪狂犬病毒XJ株为病毒模板，扩增克隆囊膜糖蛋白gD基因，扩增后的囊膜糖蛋白gD基因构建mRNA克隆载体、真核表达载体，实现体外转录mRNA后再与真核表达载体分别进行免疫原性相关研究。

【发明内容】

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗。

本发明所述的一种伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗，采用如下步骤制备：

步骤1：构建PRV-gD基因mRNA克隆质粒和真核质粒；

(1)质粒：pMD19-T线性化质粒；(2)毒株及细胞：伪狂犬病毒XJ株，BHK21细胞、Vero细胞；

步骤2：伪狂犬病毒增殖与细胞培养；

步骤3：抽提伪狂犬病毒DNA；

步骤4：设计特异性引物：

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P2：cccctcgagctacggaccgggctgcgcttt

P3：

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上游单划线部分为限制性酶切位点BamHI，下游单划线部分为限制性酶切位点XhoI，双划线部分为T7启动子；扩增片段为分别为1286bp和1305bp；