[发明专利]P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法

摘要

本发明提供一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，通过细胞培养，转染，RNA抽提和荧光定量PCR检测，免疫印迹试验，CCK8增殖检测，transwell迁移和侵袭实验，凋亡流式检测，实现对膀胱癌细胞中P3H4基因的检测，进而由P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，对膀胱癌实现更准确的影响分析。TCGA数据库结果分析显示，在膀胱癌中，P3H4高表达。且低表达P3H4后膀胱癌患者愈后效果更佳。

主权项

1.一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤1、细胞培养：膀胱癌细胞EJ、T24购自上海中科院细胞库，使用RP MI‑1640培养液于37℃，5％CO2环境下常规培养，血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验；待孔板中的细胞密度达到80％时，对细胞进行加转染，转染P3H4；步骤2、转染：按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染，具体为，待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液；脂质体Lipofectamine2000 10ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ul质粒溶于250ul无血清无抗生素培养基中；30min内混合脂质体和质粒混合液，轻轻混匀后室温静置30min；弃去6孔板中的旧培养基，PBS清洗细胞2次；将500ul脂质体和质粒混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养；将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液；24h后观察转入质粒表达情况或进行后续实验；步骤3、RNA抽提和荧光定量PCR检测：使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果；步骤4、免疫印迹试验Western blot：细胞转染质粒48小时后，将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min；垂直电泳槽内每孔内加入20μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ECL显影；QUANTITY ONE软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量；步骤5、CCK8增殖检测：将转染质粒24小时后的细胞消化计数，制备细胞悬液，取100ul细胞悬液，以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，二氧化碳培养箱中常规培养，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ul CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线；步骤6、transwell迁移和侵袭实验：将提前过夜融解的Matrigel基质胶100ul(无血清培养液按1：6稀释)加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃二氧化碳培养箱中静置4‑6小时成胶，后吸干培养液，下室中加500ul无血清培养液，静置半小时水化基底膜。将转染质粒24h后的细胞使用无血清培养制备细胞悬液，100ul细胞悬液(1×10⁵个)加入到上室中，下室中加入500ul完全培养液；过夜后，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS清洗后，4％多聚甲醛固定30min；0.1％结晶紫染色20min，PBS清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数；步骤7、凋亡流式检测：细胞转染质粒24h后，移去培养基，更换成无血清培养基，常规条件下培养饥饿24h。收集细胞：使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，收集细胞到离心管中，1000rpm离心5min，再次加入4℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清；加入1X结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1‑5×10⁶/ml；取100ul细胞悬液至于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min；加入10ul PI染液，并加400ulPBS后进行检测。