[发明专利]P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法

说明书

本发明提供一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，通过细胞培养，转染，RNA抽提和荧光定量PCR检测，免疫印迹试验，CCK8增殖检测，transwell迁移和侵袭实验，凋亡流式检测，实现对膀胱癌细胞中P3H4基因的检测，进而由P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，对膀胱癌实现更准确的影响分析。TCGA数据库结果分析显示，在膀胱癌中，P3H4高表达。且低表达P3H4后膀胱癌患者愈后效果更佳。

技术领域

本发明涉及一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。膀胱癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素。较为明确的两大致病危险因素是吸烟和职业接触芳香胺类化学物质。目前比较公认的观点是病毒或某些化学致癌物作用于人体，使原癌基因激活，抑癌基因失活而致癌。

膀胱癌细胞凋亡与基因的研究，能够有助于研究基因对膀胱癌细胞凋亡的影响，进而对膀胱癌实现更准确的影响分析。目前尚缺乏该方面的准确研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法解决现有技术中存在的如何实现膀胱癌细胞凋亡的预测分析的问题。

本发明的技术解决方案是：

一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，包括以下步骤，

步骤1、细胞培养：膀胱癌细胞EJ、T24购自上海中科院细胞库，使用RPMI-1640培养液于37℃，5％CO2环境下常规培养，血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验；待孔板中的细胞密度达到80％时，对细胞进行加转染，转染P3H4；

步骤2、转染：按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染，具体为，待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液；脂质体Lipofectamine2000 10ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ul质粒溶于250ul无血清无抗生素培养基中；30min内混合脂质体和质粒混合液，轻轻混匀后室温静置30min；弃去6孔板中的旧培养基，PBS清洗细胞2次；将500ul脂质体和质粒混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养；将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液；24h后观察转入质粒表达情况或进行后续实验；

步骤3、RNA抽提和荧光定量PCR检测：使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果；

步骤4、免疫印迹试验Western blot：细胞转染质粒48小时后，将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min；垂直电泳槽内每孔内加入20μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ECL显影；QUANTITY ONE软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量；