[发明专利]不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法

摘要

本发明涉及医疗技术领域，公开了不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，包括如下步骤：试验动物及其组织的处理；总RNA提取及cDNA合成；引物设计、合成和PCR检测；序列测定；相对定量标准曲线的建立；Tp53 mRNA水平检测；数据处理以及结果分析。本发明的不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，建立CIA大鼠模型，通过PCR检测引物特异性，建立标准曲线，qRT‑PCR检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后Tp53 mRNA的表达水平，相比现有技术，本发明可以为研究CIA大鼠Tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据。

主权项

1.不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，其特征在于，包括如下材料：Wistar雌性大鼠、饲喂基础日粮+水、牛II型胶原、甲氨蝶呤、二妙散用药组，试验步骤如下：步骤一：试验动物及其组织的处理选取72只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为6个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛II型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(MTX)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；IV组，高浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持续3周；V组，中浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持续3周；VI组，低浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持续3周；步骤二：总RNA提取及cDNA合成取出‑80℃保存的CIA大鼠关节组织，按照RNAiso Plus操作说明提取总RNA，核酸蛋白测定仪ND‑2000测定总RNA浓度和纯度，RNA浓度调至1.0μg·L‑1，‑80℃保存，根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒操作说明，反转录；步骤三：引物设计、合成和PCR检测根据NCBI GenBank公布的大鼠Tp53 cDNA参考序列，使用Primer 5.0设计1对Tp53特异性引物，送公司合成，使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100pmol/μL，‑20℃保存备用，使用15μL PCR反应体系：正反向引物(10μmol·L‑1)各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2×M5 HiPerTaq PCR mix(with Green Dye)7.5μL；步骤四：序列测定按照pEASY‑T3 cloning Kit说明，将回收的Tp53 cDNA片段连接至T3 Cloing Vector，PCR仪中25℃恒温10min，使回收产物与T3 Cloing Vector充分连接，连接产物导入感受态细胞，涂布到LB固体培养基，37℃过夜培养，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，LB液体培养基培养12‑16h，菌液交由公司测序；步骤五：相对定量标准曲线的建立将含Tp53 cDNA模板按照2×稀释8个梯度，制备标准品，分别为：1.0×20，1.0×2‑1，1.0×2‑2，1.0×2‑3，1.0×2‑4，1.0×2‑5，1.0×2‑6，1.0×2‑7，使用CFX96TM实时PCR检测系统检测，ddH2O代替模板作为阴性对照，qRT‑PCR反应体系为：TB Green Advantage qPCR Premix 10μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 7.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10sec，95℃ 5sec，60℃ 25sec，共45个循环；步骤六：Tp53 mRNA水平检测qRT‑PCR检测试验大鼠关节中Tp53 mRNA相对表达量，根据TB Green qPCR Master Mix‑TB Green Advantage试剂盒建议的反应条件，构建反应体系同步骤五，每个样本重复3次，根据Ct值，利用2‑ΔΔCt法计算试验大鼠关节中Tp53 mRNA相对表达量；步骤七：数据处理使用SPSS 24.0软件分析所有数据，统计分析基于ANOVA，Duncan法进行多重比较，图使用Origin 2017生成。