[发明专利]不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法

说明书

本发明涉及医疗技术领域，公开了不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，包括如下步骤：试验动物及其组织的处理；总RNA提取及cDNA合成；引物设计、合成和PCR检测；序列测定；相对定量标准曲线的建立；Tp53 mRNA水平检测；数据处理以及结果分析。本发明的不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，建立CIA大鼠模型，通过PCR检测引物特异性，建立标准曲线，qRT‑PCR检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后Tp53 mRNA的表达水平，相比现有技术，本发明可以为研究CIA大鼠Tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据。

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、系统性自身免疫性疾病。基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。我国RA患病率为0.32％-0.36％，其中女性发病率是男性的1-3倍，是威胁人类健康的重大疾病之一，属WHO规定的现代难治病范畴。胶原诱导关节炎模型(collagen induced arthritis CIA)是一种经典的类风湿关节炎动物模型，被广泛应用于评估可能的病因病理，也被用于评估新的治疗方法。目前对动物模型的研究以对关节滑膜炎症、骨及软骨破坏为主，对其他脏器的研究较少。

二妙散作为中医治疗类风湿关节炎的经典方剂，出自《丹溪心法》由苍术和黄柏等比配伍而成，黄柏苦寒清热，苍术苦温燥湿，为祛湿剂，具有清热燥湿之功效，为治阴分之湿热痿证的妙药。Tp53肿瘤抑制基因调节机体生物过程的发生，如应激反应、细胞周期、增殖、侵袭、衰老、细胞凋亡和自噬，其编码蛋白(p53)主要通过诱导生长停滞、细胞凋亡、衰老和抑制血管生成，从而引起关节滑膜纤维化，导致炎症的发生。目前，二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制还缺乏理论依据。

发明内容

发明的目的在于提供不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，本发明建立CIA大鼠模型，通过PCR检测引物特异性，建立标准曲线，qRT-PCR检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后Tp53 mRNA的表达水平，相比现有技术，本发明可以为研究CIA大鼠Tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53 mRNA水平表达的试验方法，包括如下材料：Wistar雌性大鼠、饲喂基础日粮+水、牛II型胶原、甲氨蝶呤、二妙散用药组，试验步骤如下：

步骤一：试验动物及其组织的处理

选取72只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为6个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛II型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(MTX)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；IV组，高浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持续3周；V组，中浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持续3周；VI组，低浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持续3周；

步骤二：总RNA提取及cDNA合成