[发明专利]一种体外表皮三维模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种体外表皮三维模型的建立方法，包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养。本发明通过将饲养层细胞和角质细胞共培养，得到体外表皮模型，此构建过程不使用胶原支架，依赖细胞自身分泌的细胞外基质构建，通过HE染色检测，显示该体外表皮模型与人体皮肤结构相似；在角质细胞的制备过程中，使用基质胶包被的培养板进行培养，该基质胶可模拟体内Hacat细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于Hacat细胞的体外培养和分化，通过这种方法培养的Hacat细胞，避免了检测结果上的局限性和滞后性；通过对该体外表皮模型进行皮肤体外刺激性实验，表明该体外表皮模型的组织生存率和组织灵敏度均满足皮肤测试的要求。

主权项

1.一种体外表皮三维模型的建立方法，其特征在于：包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养，具体方法步骤如下：步骤a：取冻存的3T3‑Swiss albino细胞，复苏后，经处理，播种至transwell Ⅰ底部培养，得饲养层细胞；步骤b：角质细胞的制备，包括：步骤b1.取冻存的Hacat细胞，复苏后，接种至T25培养瓶中培养，细胞生长至70％‑80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T75培养瓶Ⅱ中进行传代培养，得Hacat细胞Ⅱ；步骤b2.使用基质胶对transwell Ⅱ进行包被，设定transwell Ⅱ的位置为高位置；步骤b3.将所述Hacat细胞Ⅱ培养至80％‑90％融合度，得Hacat细胞Ⅲ，将所述Hacat细胞Ⅲ使用胰酶进行消化处理，收集消化处理后的所述Hacat细胞Ⅲ，接种至所述transwell Ⅱ内，得角质细胞；步骤c：饲养层细胞和角质细胞的共培养，包括：步骤c1.使用PBS缓冲液对所述饲养层细胞进行清洗，清洗完成后，向所述transwell Ⅰ内加入Hacat细胞增殖培养基；步骤c2.将所述transwell Ⅱ放置于所述饲养层细胞上方进行共培养，共培养4d后，吸去所述transwell Ⅱ和所述transwell Ⅰ内的增殖培养基，吸取完成后，向所述transwell Ⅰ底部加入Hacat分化培养基，进行气升式培养；步骤c3.气升式培养4d后，更换所述transwell Ⅰ底部的Hacat分化培养基，继续培养3d后，更换所述transwell Ⅰ内的饲养层细胞；步骤c4.重复步骤c3；步骤c5.气升式培养完成，得表皮三维模型样品；步骤d：对所述表皮三维模型样品进行组织灵敏度实验和组织生存率实验；步骤e：对所述表皮三维模型样品进行HE染色检测。