[发明专利]一种体外表皮三维模型的建立方法

权利要求书

1.一种体外表皮三维模型的建立方法，其特征在于：包括饲养层细胞的制备、角质细胞的制备以及饲养层细胞和角质细胞的共培养，具体方法步骤如下：

步骤a：取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，经处理，播种至transwell Ⅰ底部培养，得饲养层细胞；

步骤b：角质细胞的制备，包括：

步骤b1.取冻存的Hacat细胞，复苏后，接种至T25培养瓶中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T75培养瓶Ⅱ中进行传代培养，得Hacat细胞Ⅱ；

步骤b2.使用基质胶对transwell Ⅱ进行包被，设定transwell Ⅱ的位置为高位置；

步骤b3.将所述Hacat细胞Ⅱ培养至80％-90％融合度，得Hacat细胞Ⅲ，将所述Hacat细胞Ⅲ使用胰酶进行消化处理，收集消化处理后的所述Hacat细胞Ⅲ，接种至所述transwellⅡ内，得角质细胞；

步骤c：饲养层细胞和角质细胞的共培养，包括：

步骤c1.使用PBS缓冲液对所述饲养层细胞进行清洗，清洗完成后，向所述transwell Ⅰ内加入Hacat细胞增殖培养基；

步骤c2.将所述transwell Ⅱ放置于所述饲养层细胞上方进行共培养，共培养4d后，吸去所述transwell Ⅱ和所述transwell Ⅰ内的增殖培养基，吸取完成后，向所述transwellⅠ底部加入Hacat分化培养基，进行气升式培养；

步骤c3.气升式培养4d后，更换所述transwell Ⅰ底部的Hacat分化培养基，继续培养3d后，更换所述transwell Ⅰ内的饲养层细胞；

步骤c4.重复步骤c3；

步骤c5.气升式培养完成，得表皮三维模型样品；

步骤d：对所述表皮三维模型样品进行组织灵敏度实验和组织生存率实验；

步骤e：对所述表皮三维模型样品进行HE染色检测。

2.根据权利要求1所述的一种体外表皮三维模型的建立方法，其特征在于：所述步骤a的具体操作过程为：

步骤a1.取冻存的3T3-Swiss albino细胞，复苏后，接种至T75培养瓶Ⅰ中培养，细胞生长至70％-80％的融合度，使用胰酶进行消化，消化后的细胞，接种至T150培养瓶中进行传代培养，细胞生长至100％融合度，得3T3细胞Ⅱ；

步骤a2.使用丝裂霉素C对所述3T3细胞Ⅱ进行处理，处理时间为2h，，处理完成后，使用所述PBS缓冲液对所述3T3细胞Ⅱ进行清洗，清洗完成后，使用胰酶对所述3T3细胞Ⅱ进行消化处理，得3T3细胞Ⅲ；

步骤a3.收集所述3T3细胞Ⅲ，播种至transwell Ⅰ底部，培养1-3天，至所述3T3细胞Ⅲ完全贴壁，得饲养层细胞。