[发明专利]一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法

摘要

本发明提供了一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，涉及农业生物技术领域。本发明的技术方案由以下步骤组成：S1获得雪莲果无性繁殖系、S2低温锻炼、S3渗透包埋、S4脱水与液氮保存、S5化冻与洗涤、S6植株再生。本发明的种质保存方法简便易行、稳定性高、一次保存可以长期稳定存放，并且经保存后的茎尖存活率仍然高达80%以上，植株再生率高达75%以上，同时本发明的方法还可以对雪莲果种质资源进行脱毒纯化，从而提高种苗质量，为生产提供更多优质脱毒种苗，具有广阔的市场前景。

主权项

1.一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，该方法的技术方案由以下步骤组成： S1获得雪莲果无性繁殖系剪取雪莲果苗的腋芽先用0.1%洗衣粉水浸泡15‑20min，接着用自来水冲洗干净，将腋芽剥取至生长点后进行消毒处理，然后接种于附加KT2.0mg/L、IAA 0.5mg/L、水解蛋白35mg/L、聚乙烯醇0.2mg/L 的MS培养基上诱导出不定芽；将不定芽转接到附加康多酚1.0mg/L、三十烷醇0.3mg/L、柠檬酸钛3.5mg/L的 MS培养基上进行继代增殖，每30天继代1次；培养条件均控制为温度23‑27℃、光照强度2000‑2400lx、光照时间11‑13h/d；S2低温锻炼选择继代1次又培养10天左右的雪莲果试管苗，置于2‑8℃暗处低温锻炼3‑4周；S3渗透包埋从上述低温锻炼后的试管苗上切取茎尖作为种质保存材料，将茎尖经过渗透包埋处理后，可形成直径约为4mm的包埋珠，每个包埋珠包含1个茎尖；S4预培养与装载将上述包埋珠接入预培养基中，置于4℃黑暗条件下培养2‑4d；然后在室温下，将经预培养的包埋珠转入附加2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的液体MS培养基中装载处理40‑60min；S5脱水与液氮保存将装载处理后的包埋珠放入冷冻保护液中，在0℃冰浴条件下脱水60‑90min；然后将包埋珠装入10ml冷冻离心管中，并添加2.5ml左右的新鲜冷冻保护液，迅速投入液氮中进行冷冻保存，每个冷冻离心管中放6‑10个包埋珠；S6化冻与洗涤种质保存期结束后，迅速将冷冻离心管取出并置于36‑40℃水浴化冻1‑2 min，之后在室温下化冻20min，然后从包埋珠中取出茎尖用附加1.1mol/L山梨糖醇的液体MS培养基洗涤10min，再接种至再生培养基上；S7植株再生将接种后的茎尖，先在0‑4℃条件下暗培养1周，然后在温度23‑27℃、光照强度2000‑2500lx、光照时间12‑14h/d的条件下培养4‑5周，获得再生植株。