[发明专利]一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法在审
申请号: | 201811160681.2 | 申请日: | 2018-09-30 |
公开(公告)号: | CN109329050A | 公开(公告)日: | 2019-02-15 |
发明(设计)人: | 宋晓燕 | 申请(专利权)人: | 宋晓燕 |
主分类号: | A01H4/00 | 分类号: | A01H4/00;A01N3/00 |
代理公司: | 长沙新裕知识产权代理有限公司 43210 | 代理人: | 赵登高 |
地址: | 276309 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 雪莲果 种质保存 超低温技术 植株再生 农业生物技术 无性繁殖系 长期稳定 低温锻炼 脱毒种苗 液氮保存 一次保存 种质资源 存活率 包埋 茎尖 脱毒 种苗 脱水 洗涤 保存 生产 | ||
1.一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,该方法的技术方案由以下步骤组成:
S1获得雪莲果无性繁殖系
剪取雪莲果苗的腋芽先用0.1%洗衣粉水浸泡15-20min,接着用自来水冲洗干净,将腋芽剥取至生长点后进行消毒处理,然后接种于附加KT2.0mg/L、IAA 0.5mg/L、水解蛋白35mg/L、聚乙烯醇0.2mg/L 的MS培养基上诱导出不定芽;将不定芽转接到附加康多酚1.0mg/L、三十烷醇0.3mg/L、柠檬酸钛3.5mg/L的 MS培养基上进行继代增殖,每30天继代1次;培养条件均控制为温度23-27℃、光照强度2000-2400lx、光照时间11-13h/d;
S2低温锻炼
选择继代1次又培养10天左右的雪莲果试管苗,置于2-8℃暗处低温锻炼3-4周;
S3渗透包埋
从上述低温锻炼后的试管苗上切取茎尖作为种质保存材料,将茎尖经过渗透包埋处理后,可形成直径约为4mm的包埋珠,每个包埋珠包含1个茎尖;
S4预培养与装载
将上述包埋珠接入预培养基中,置于4℃黑暗条件下培养2-4d;然后在室温下,将经预培养的包埋珠转入附加2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的液体MS培养基中装载处理40-60min;
S5脱水与液氮保存
将装载处理后的包埋珠放入冷冻保护液中,在0℃冰浴条件下脱水60-90min;然后将包埋珠装入10ml冷冻离心管中,并添加2.5ml左右的新鲜冷冻保护液,迅速投入液氮中进行冷冻保存,每个冷冻离心管中放6-10个包埋珠;
S6化冻与洗涤
种质保存期结束后,迅速将冷冻离心管取出并置于36-40℃水浴化冻1-2 min,之后在室温下化冻20min,然后从包埋珠中取出茎尖用附加1.1mol/L山梨糖醇的液体MS培养基洗涤10min,再接种至再生培养基上;
S7植株再生
将接种后的茎尖,先在0-4℃条件下暗培养1周,然后在温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、光照时间12-14h/d的条件下培养4-5周,获得再生植株。
2.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,所述S1中消毒处理的方法为:先用70%酒精表面消毒30s,再用无菌水冲洗2-3次,然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10min,再用无菌水冲洗4-5次,滤纸吸干水分。
3.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,所述S3中茎尖的要求为长约2-3mm,含有1-3个叶原基。
4.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,所述S3中茎尖的渗透包埋方法为:将茎尖悬浮于包埋液①中形成混合物,然后用小滴管将茎尖混合物逐个滴加入包埋液②中,在常温下固定20-40min。
5.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,所述S4中预培养基的配方为:1/2MS+丁酰肼0.22~0.30mg/L+天门冬酰胺10~14mg/L+石榴籽粉36~40mg/L+甜菜碱1.3~1.5mg/L+水杨酸8.2~8.8mg/L+油菜素内酯0.01~0.03mg/L+蔗糖0.4~0.6mol/L+丙二醇51~55g/L,pH值为5.6~6.0。
6.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法,其特征在于,所述S4中冷冻保护液的成分为为:MS(不含琼脂)+35%(w/v)甘油+10%(w/v)乙二醇+5%(w/v)DMSO+0.3mol/L蔗糖+海藻糖41~47g/L+左旋肉碱4.4~5.0mg/L+谷胱甘肽30~40mg/L+水溶性碳纳米管0.8~1.0g/L+螺旋藻粉3.5~4.1g/L。
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