[发明专利]一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法

权利要求书

1.一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，该方法的技术方案由以下步骤组成：

S1获得雪莲果无性繁殖系

剪取雪莲果苗的腋芽先用0.1%洗衣粉水浸泡15-20min，接着用自来水冲洗干净，将腋芽剥取至生长点后进行消毒处理，然后接种于附加KT2.0mg/L、IAA 0.5mg/L、水解蛋白35mg/L、聚乙烯醇0.2mg/L 的MS培养基上诱导出不定芽；将不定芽转接到附加康多酚1.0mg/L、三十烷醇0.3mg/L、柠檬酸钛3.5mg/L的 MS培养基上进行继代增殖，每30天继代1次；培养条件均控制为温度23-27℃、光照强度2000-2400lx、光照时间11-13h/d；

S2低温锻炼

选择继代1次又培养10天左右的雪莲果试管苗，置于2-8℃暗处低温锻炼3-4周；

S3渗透包埋

从上述低温锻炼后的试管苗上切取茎尖作为种质保存材料，将茎尖经过渗透包埋处理后，可形成直径约为4mm的包埋珠，每个包埋珠包含1个茎尖；

S4预培养与装载

将上述包埋珠接入预培养基中，置于4℃黑暗条件下培养2-4d；然后在室温下，将经预培养的包埋珠转入附加2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的液体MS培养基中装载处理40-60min；

S5脱水与液氮保存

将装载处理后的包埋珠放入冷冻保护液中，在0℃冰浴条件下脱水60-90min；然后将包埋珠装入10ml冷冻离心管中，并添加2.5ml左右的新鲜冷冻保护液，迅速投入液氮中进行冷冻保存，每个冷冻离心管中放6-10个包埋珠；

S6化冻与洗涤

种质保存期结束后，迅速将冷冻离心管取出并置于36-40℃水浴化冻1-2 min，之后在室温下化冻20min，然后从包埋珠中取出茎尖用附加1.1mol/L山梨糖醇的液体MS培养基洗涤10min，再接种至再生培养基上；

S7植株再生

将接种后的茎尖，先在0-4℃条件下暗培养1周，然后在温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、光照时间12-14h/d的条件下培养4-5周，获得再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，所述S1中消毒处理的方法为：先用70%酒精表面消毒30s，再用无菌水冲洗2-3次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干水分。

3.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，所述S3中茎尖的要求为长约2-3mm，含有1-3个叶原基。

4.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，所述S3中茎尖的渗透包埋方法为：将茎尖悬浮于包埋液①中形成混合物，然后用小滴管将茎尖混合物逐个滴加入包埋液②中，在常温下固定20-40min。

5.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，所述S4中预培养基的配方为：1/2MS+丁酰肼0.22~0.30mg/L+天门冬酰胺10~14mg/L+石榴籽粉36~40mg/L+甜菜碱1.3~1.5mg/L+水杨酸8.2~8.8mg/L+油菜素内酯0.01~0.03mg/L+蔗糖0.4~0.6mol/L+丙二醇51~55g/L，pH值为5.6~6.0。

6.根据权利要求1所述的一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，所述S4中冷冻保护液的成分为为：MS（不含琼脂）+35%（w/v）甘油+10%（w/v）乙二醇+5%（w/v）DMSO+0.3mol/L蔗糖+海藻糖41~47g/L+左旋肉碱4.4~5.0mg/L+谷胱甘肽30~40mg/L+水溶性碳纳米管0.8~1.0g/L+螺旋藻粉3.5~4.1g/L。