[发明专利]一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法

摘要

本发明提供一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其步骤包括：步骤1.溶胀树脂；步骤2.脱除芴甲氧羰基保护基，步骤3.氨基酸的偶联反应，步骤4：多肽切割；步骤5：分离纯化；步骤6:多肽的表征；步骤7:肽与DNA的相互作用；本发明解决了现阶段多肽固相合成的存在的弊端，提高了偶联效率与合成产率，合成产率达到60％以上；本方法合成的五条多肽P1、P2、P3、P4、P5；利用反相高效液相色谱法将合成的各种肽进行分离纯化，使用质谱对目标肽进行表征，结果表明所合成的产物均为相应的目标肽，纯度均在95％以上；此外，所合成的多肽具有不同的结构，其中P3的序列结构可为以特定DNA为靶点的多肽类药物的设计提供了基础信息与支持。

主权项

1.一种结合DNA的多肽结构域的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：溶胀树脂：称取1.0～1.5g,担载量为0.38mmol/g的Fmoc‑L‑Gly‑Wang Resin，置于洁净干燥的固相合成管中，加入15～30mL的DMF，通入氮气通搅拌30～40min后，减压抽滤除去DMF，再分别用15mL的DMF洗涤树脂三次，滤除溶剂即得到溶胀好的树脂；步骤2：脱除芴甲氧羰基保护基：避光条件下在步骤1中得到的溶胀好的树脂中加入20mL的脱保护试剂，之后充氮气搅拌10min后减压抽滤，再加入20mL脱保护试剂，通氮气搅拌25min后减压抽滤掉保护试剂，然后检测树脂是否脱除芴甲氧羰基保护基；脱除Fmoc保护基成功后，用20mL的DMF和20mL的甲醇交替对树脂洗涤7次，每次洗涤时间不低于3min；步骤3：氨基酸的偶联反应：称取0.45～0.68g的Fmoc‑L‑Thr(tBu)‑OH，0.16～0.23g的HOAT，置于50mL干燥洁净的小烧杯中，加入10～20mL DMF进行溶解，溶解后再加入0.14～0.22g浓度为0.815g/mL的DIC，混匀活化15min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤步骤2得到的树脂，每次加入10～20mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全；若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸；重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止；步骤4：多肽切割：所有的氨基酸偶联成功后，将最后一个氨基酸的保护基去除后，用甲醇进行洗涤，并用氮气吹干；将干燥的树脂与配置好的切割试剂混合，磁力搅拌3h；然后用砂芯漏斗抽滤，将滤液与100～125mL冰乙醚混合，置于冰箱中3‑4h后取出，放入离心机，以3800r/min离心10min；用‑10℃的冰乙醚30mL洗涤沉淀三次，并用氮气吹干，得到固体粉末即为固相合成的产物；并在‑20℃保存。步骤5：分离纯化:取适量合成肽用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪RP‑HPLC进行分离纯化；步骤6:多肽的表征:称取一定量的多肽，用0.05mol/L的Tris‑HCl缓冲溶液完全溶解，定容于1mL容量瓶，得到多肽溶液,浓度为5×10‑4mol/L；吸取100μL配置好的多肽溶液，用Tris‑HCl缓冲溶液定容至1mL，此时多肽浓度为5×10‑5mol/L；固定多肽浓度，在多肽溶液中分别滴加体积不同的1×10‑3mol/L的Zn(NO3)2溶液，这样就制备出了一系列含有不同浓度锌离子的溶液，常温下存放一小时；之后用1.0mm规格的比色皿，设置响应时间为2s，步长是2nm，在190‑320nm波长区间内对它们分别扫描，扫描速度为每分钟100nm，反复扫3次，绘制出圆二色谱图；步骤7：多肽与DNA的相互作用：在锌离子与多肽浓度都为5×10‑4mol/L的混合溶液中，分别滴加不同体积的浓度为5.0×10‑4mol/L的DNA溶液；室温下放置1小时；使用3mL规格的比色皿，设置λex＝227nm，狭缝宽度是10nm，扫描它们的荧光图谱。