[发明专利]雄激素受体剪接突变体AR-V7的免疫荧光检测试剂盒及应用

摘要

本发明涉及一种雄激素受体剪接突变体AR‑V7的免疫荧光检测试剂盒及应用，本发明所述方法，检测原理如下：首先富集非体液性稀有有核细胞，然后根据抗原抗体反应原理，采用免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的非体液性稀有有核细胞进行判读和计数。

主权项

1.一种检测非体液性稀有有核细胞中AR‑V7表达的方法，所述方法，步骤如下：1)稀有有核细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的非体液性稀有有核细胞进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD‑G液，2)将富集的稀有有核细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的AR‑V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；2.4)避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，2.6)复染：取10μL DAPI染液，加至标本区，2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或‑20℃环境下避光保存，3)对样本进行镜检观察将标本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，4)结果判断阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，同时记录阳性信号的细胞定位，阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。