[发明专利]雄激素受体剪接突变体AR-V7的免疫荧光检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测非体液性稀有有核细胞中AR-V7表达的方法，所述方法，步骤如下：

1)稀有有核细胞的富集

取血液和其他体液样品，对其中的非体液性稀有有核细胞进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，

富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD-G液，

2)将富集的稀有有核细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：

2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；

2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；

2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的AR-V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；

2.4)避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，

2.6)复染：取10μL DAPI染液，加至标本区，

2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存，

3)对样本进行镜检观察

将标本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，

4)结果判断

阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，同时记录阳性信号的细胞定位，

阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程中需要使用到荧光素，所述荧光素优先使用绿色荧光、橘色荧光、红色或深红色荧光的组合，选自：Alexa Fluor、Dylight、华青染料、异硫氰酸荧光素、生物素、量子点、Texas Red、藻红蛋白、藻蓝蛋白、罗丹明。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程中使用的CD45抗体是针对白细胞通用抗原的抗体，用于排除血源性细胞，也可以选自以下抗体：CD3、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD34、CD35、CD36、CD38、CD41、CD58、CD61、CD66b、CD235a。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法可以与荧光原位杂交(FISH)技术联用，步骤为以下任一种：(i)：先用免疫荧光检测再进行荧光原位杂交；(ii)：先用荧光原位杂交再进行免疫荧光检测；(iii)：同时进行免疫荧光检测和荧光原位杂交。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的缓冲液CYP1、CYP2、CYPP中含有表面活性剂和蛋白保护剂，表面活性剂选自：0～10％的Triton X-100、saponin、Tween、NP-40、SDS、聚乙二醇；蛋白保护剂选自：0～10％的BSA、海藻糖、蔗糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的封闭液选自：动物血清、0.5％～10％BSA、Fc受体抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的修复方法选自：酶消化修复、EDTA修复、高压修复、微波修复。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测过程使用的核染料选自DAPI，Hoechst、碘化丙啶。