[发明专利]一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法

摘要

本发明属于动物病毒学技术领域。具体涉及一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法。所述的猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。本发明采用差速离心去杂质、利用聚乙二醇(PEG)6000沉淀浓缩病毒，再通过蔗糖梯度离心纯化病毒等步骤，最大限度降低了病毒样品中的杂质含量，浓缩了病毒。本发明制备的病毒样品尤其适用于接种细胞和分离病毒。相对于现有技术制备的病毒样品，对细胞的毒性大幅度下降，病毒分离率显著提高，分离率可由传统方法的10％左右提高到40％以上。

主权项

1.一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法，其步骤包括：病料检测、阳性小肠内容物收集与稀释、冻融、离心、取上清加抗生素处理、过滤除菌和接种细胞；其特征在于，在过滤除菌之后和接种细胞步骤之前增加聚乙二醇沉淀浓缩病毒和蔗糖梯度离心纯化病毒的步骤，如下所述：(1)取16mL阳性仔猪小肠内容物的滤液，加入4mL浓度为2.5mol/L的NaCl溶液，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，在12000r/min下离心1h，吸弃上清，得沉淀；(2)向沉淀中加入2mL无血清DMEM培养液，于2～8℃下重悬过夜；(3)将3种不同浓度的蔗糖溶液加入到无菌的超速离心管中：先加3.5mL 30％的蔗糖溶液，再用加样针伸到超速离心管底部注入3.5mL 45％的蔗糖溶液，最后用加样针伸到超离管底部注入3.5mL 60％的蔗糖溶；取2mL重悬的样品加到30％蔗糖垫层的上面，在30000r/min离心3h,离心后在30％蔗糖与45％蔗糖之间可见乳白色的猪流行性腹泻病毒(PEDV)病毒带或猪δ冠状病毒(PDCoV)病毒带或猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)病毒带；(4)用加样针分别吸取PEDV病毒带或PDCoV病毒带或TGEV病毒带转移至另一个无菌超速离心管中，补加无血清DMEM培养液至12.5mL，在30000r/min下离心4h，吸弃上清，沉淀用1mL无血清DMEM培养液于2～8℃重悬过夜。