[发明专利]一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法

说明书

本发明属于动物病毒学技术领域。具体涉及一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法。所述的猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。本发明采用差速离心去杂质、利用聚乙二醇(PEG)6000沉淀浓缩病毒，再通过蔗糖梯度离心纯化病毒等步骤，最大限度降低了病毒样品中的杂质含量，浓缩了病毒。本发明制备的病毒样品尤其适用于接种细胞和分离病毒。相对于现有技术制备的病毒样品，对细胞的毒性大幅度下降，病毒分离率显著提高，分离率可由传统方法的10％左右提高到40％以上。

技术领域

本发明属于动物病毒学技术领域。具体涉及一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法。所述的猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)均属于套式病毒目、冠状病毒科，是引起猪肠道感染，导致腹泻的三种主要病毒，尤其是PEDV和PDCoV近年来在临床上感染严重，给养猪业造成了巨大的经济损失。

病毒分离是疾病诊断的重要依据，也是疫苗研制的关键和诊断方法建立的前提，但猪肠道冠状病毒存在分离难度大、分离率低、分离率不稳定的问题，低的分离率为3％-5％，高的也只有10％左右(Zhang Jianqiang.Porcine deltacoronavirus:Overview ofinfection dynamics,diagnosticmethods,prevalence and genetic evolution.VirusResearch.2016,226:71–84.)。由于获得病毒的难度大，从而严重影响了猪肠道冠状病毒预防措施的制订、利用和相关基础研究的发展，当前急需建立一种稳定、高效的猪肠道冠状病毒分离方法。传统的分离猪肠道冠状病毒的方法为：采集发病猪的粪便或小肠内容物，加入一定量的PBS或DMEM或其它细胞培养液，混合均匀后反复冻融3次，在5000r/min下离心15min，取上清至另一无菌离心管中，在10000r/min下离心1h，取上清，加入双抗，于2～8℃下作用4h以上，再用滤器过滤除菌，取滤液接种敏感细胞。由于粪便和小肠内容物均对细胞的毒性较大，接种量大时往往导致细胞不能正常生长，甚至裂解死亡，因此病毒也不能有效增殖；接种量小时，由于病毒的含量低，很难分离到病毒。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术存在的缺陷，采用差速离心去杂质、利用聚乙二醇(PEG)6000沉淀浓缩病毒，再通过蔗糖梯度离心纯化病毒等步骤，最大限度降低了猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)病毒样品中的杂质含量，浓缩了病毒。本发明制备的病毒样品尤其适用于接种细胞，分离病毒。相对于现有技术制备的病毒样品，对细胞的毒性大幅度下降，病毒分离率显著提高，分离率可由传统方法的10％左右提高到40％以上。

实现本发明目的的技术方案如下所述：

一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法，其步骤包括：病料检测、阳性小肠内容物收集与稀释、冻融、离心、取上清加抗生素处理、过滤除菌和接种细胞；其特征在于，在过滤除菌之后和接种细胞之前增加了聚乙二醇沉淀浓缩病毒和蔗糖梯度离心纯化病毒的步骤，具体步骤如下所述；

(1)取16mL阳性仔猪小肠内容物的滤液，加入4mL浓度为2.5mol/L的NaCl溶液，混匀后加入等体积的浓度为10％的聚乙二醇6000溶液，于2～8℃下搅拌沉淀24h，在12000r/min下离心1h，吸弃上清，得沉淀；

(2)向沉淀中加入2mL无血清DMEM培养液，于2～8℃下重悬过夜；