[发明专利]一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法

摘要

本发明公开了一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。它的步骤如下：取成体饰纹姬蛙进行表面消毒；解剖取出腿肌用HBSS平衡盐溶液清洗；依次经胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶消化；组织悬液经切尖吸头和不切尖吸头吹打挤压后，依次经100μm孔径和40μm孔径细胞过滤网过滤制得细胞悬液；27℃恒温培养，每隔3‑4天换新的细胞完全培养基。本发明能快速、可重复地建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强。本发明是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，为陆生适应性、变态发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题提供了新的细胞材料。

主权项

1.一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5‑2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0‑1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7‑15分钟，离心条件为：离心力500‑800g，温度4‑6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0‑1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7‑15分钟，离心条件为：离心力500‑800g，温度4‑6℃；(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)过滤；(14)滤液(见11，13)用40μm孔径细胞过滤网再过滤一次；(15)再加入1.0‑4.0mL细胞完全培养基入40μm孔径细胞过滤网(见14)过滤；(16)将(14)(15)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；(17)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；(18)每隔3‑4天换细胞完全培养基。整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。