[发明专利]一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法

说明书

本发明公开了一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。它的步骤如下：取成体饰纹姬蛙进行表面消毒；解剖取出腿肌用HBSS平衡盐溶液清洗；依次经胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶消化；组织悬液经切尖吸头和不切尖吸头吹打挤压后，依次经100μm孔径和40μm孔径细胞过滤网过滤制得细胞悬液；27℃恒温培养，每隔3‑4天换新的细胞完全培养基。本发明能快速、可重复地建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强。本发明是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，为陆生适应性、变态发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题提供了新的细胞材料。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，尤其涉及一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。

背景技术

1907年，哈里森(Harrison)采用悬滴培养法将蛙胚神经组织培养于淋巴液凝块中数周之久，并观察到从培养的组织块中长出了轴突，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。1913年，卡雷尔(Carrel)将外科手术中严格的无菌操作技术引入到动物细胞的体外培养中，使细胞在体外能够长期生长。1916年，劳斯(Rous)和琼斯(Jones)将胰蛋白酶消化法用于组织消化和细胞传代，标志着真正意义上的动物细胞培养的开始。1948年，厄尔(Earle)从小鼠的皮下组织分离并连续传代培养了第一种细胞系：L成纤维细胞系。2006年，山中伸弥(Yamanaka)诱导体外培养的小鼠成纤维细胞重编程为了诱导多能干细胞(iPSC)。随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。

两栖动物，尤其无尾两栖类的细胞培养已经有一定的研究基础，从豹蛙(Ranapipiens)、中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)、金线侧褶蛙(Pelophylax plancyi)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、特别是非洲爪蟾(Xenopus laevis)的胚胎，蝌蚪或成体中分离培养出了多种组织的原代细胞及细胞系(Balls and Worley 1973；Freed andMezger-Freed 1970；Sinzelle et al.2012；Smith and Tata 1991；吴政安,1978)。然而以上两栖动物细胞培养研究主要集中在动物细胞培养历史的早期阶段，自从上个世纪90年代以后就没有大的进展。动物细胞培养技术的研究近几十年主要集中于昆虫和哺乳动物,对两栖动物的关注较少。骨骼肌细胞(skeletal muscle cells)原代培养技术的研究主要集中于鼠和人，有少量兔、犬、鸡和非洲爪蟾的研究(Charge and Rudnicki 2004；Danovizand Yablonka-Reuveni 2012；Parker MH et al.2012；Shefer and Yablonka-Reuveni2008；Shibota et al.2000；Yablonka-Reuveni and Day2011)。由于骨骼肌纤维已经失去了生长传代能力，因此通常取肌原性细胞(myogenic cell)进行培养以获得骨骼肌细胞，肌原性细胞主要为肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)，少量为成肌细胞(myoblast)。早期认为肌卫星细胞在体外培养不可避免地会进入终末分化状态，因此不可传代(Yablonka-Reuveni and Day 2011)，近年发现加入P38抑制剂(SB 203580)在人肌卫星细胞培养基中(Charville et al.2015)或加入四种细胞因子(IL-1α,IL-13,TNF-α和IFN-γ)在鼠肌卫星细胞培养基中(Fu et al.2015),可多次传代。部分由成肌细胞(myoblast)构建的细胞系可多次传代，如兔源L6和L8细胞系，鼠源C2，C2C12和MM14细胞系。两栖类来源培养的骨骼肌细胞无可传代报道。