[发明专利]一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法

摘要

本发明属于贵金属纳米材料和比率荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于溶菌酶稳定的铜纳米簇复合物及其比率荧光探针的制备方法。以水合肼为还原剂，溶菌酶为稳定剂制备了铜纳米簇。胆碱氧化酶催化胆碱产生过氧化氢，过氧化氢与辣根过氧化物酶氧化邻苯二胺生成二氨基酚嗪。由于二氨基酚嗪与铜纳米簇之间发生内滤效应，随着胆碱浓度的增加，二氨基酚嗪的荧光逐渐增强，而铜纳米簇的荧光被二氨基酚嗪逐渐猝灭，基于此可构建铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光峰强度比率与胆碱浓度之间的线性关系，即制得比率荧光探针。该探针的制备方法简单，成本低，产品灵敏度高，可发展成为一种新颖的比率荧光探针，用于生物样品中胆碱的高效检测。

主权项

1.一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)铜纳米簇的制备：将2毫克五水合硫酸铜加入到5毫升二次蒸馏水中，配制成硫酸铜水溶液，在磁力搅拌下，将0.3克溶菌酶溶于10毫升二次蒸馏水，直至其完全溶解，然后将溶菌酶水溶液放置在45摄氏度的恒温水浴中孵化，在磁力搅拌下，将硫酸铜水溶液缓慢加入溶菌酶水溶液中，制备溶菌酶与硫酸铜的混合水溶液，在45摄氏度水浴中搅拌10分钟，向混合水溶液中加入1摩尔/升的氢氧化钠溶液，将pH调至10‑11，滴加质量浓度为50％的水合肼调整混合水溶液的颜色从蓝色变为紫色，然后在45摄氏度水浴中搅拌反应10‑24小时；(2)将制备的铜纳米簇混合水溶液进行高速离心处理，去除不溶物，取上层清液透析5‑10小时，透析后取出混合溶液进行旋蒸处理，将混合溶液中90％的水蒸发去除，剩余的溶液放入冷冻干燥箱中进行干燥，将干燥后得到的铜纳米簇分散于0.2摩尔/升的磷酸盐水缓冲液中备用，该缓冲液pH为7.0；(3)二氨基吩嗪混合溶液的配制：称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中，制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液，量取200微升该邻苯二胺溶液，向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升不同浓度的过氧化氢水溶液；(4)铜纳米簇与二氨基吩嗪混合溶液的配制：将步骤(3)中配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟，然后加入40微升步骤(2)中制得的磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇，缓慢搅拌均匀，在室温下放置10分钟，得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液；(5)测量步骤(4)中不同的过氧化氢摩尔浓度下，铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱，拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系；(6)量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液，向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶和10微升不同浓度的胆碱水溶液，在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟，然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中，室温下放置10分钟，得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液；(7)测定不同的胆碱浓度下，铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱，拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系，构建出检测胆碱的比率荧光探针；步骤(2)中所述的铜纳米簇尺寸为2～5纳米；步骤(3)中所述的过氧化氢摩尔浓度为1‑50毫摩尔/升；步骤(4)中所述的铜纳米簇质量浓度为5‑30克/升；步骤(7)中所述的胆碱浓度范围为0.01‑100微摩尔/升，胆碱的检测极限为5‑10纳摩尔/升。