[发明专利]一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法

说明书

本发明属于贵金属纳米材料和比率荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于溶菌酶稳定的铜纳米簇复合物及其比率荧光探针的制备方法。以水合肼为还原剂，溶菌酶为稳定剂制备了铜纳米簇。胆碱氧化酶催化胆碱产生过氧化氢，过氧化氢与辣根过氧化物酶氧化邻苯二胺生成二氨基酚嗪。由于二氨基酚嗪与铜纳米簇之间发生内滤效应，随着胆碱浓度的增加，二氨基酚嗪的荧光逐渐增强，而铜纳米簇的荧光被二氨基酚嗪逐渐猝灭，基于此可构建铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光峰强度比率与胆碱浓度之间的线性关系，即制得比率荧光探针。该探针的制备方法简单，成本低，产品灵敏度高，可发展成为一种新颖的比率荧光探针，用于生物样品中胆碱的高效检测。

技术领域：

本发明属于贵金属纳米材料和比率荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于溶菌酶稳定的铜纳米簇复合物及其比率荧光探针的制备方法，其制备的探针可用于胆碱的高效检测。

背景技术：

胆碱是哺乳动物必需的营养物质，胆碱衍生物在人类健康的发展中起着重要的作用。胆碱的前体乙酰胆碱是一种神经递质，它对神经系统和全身主要器官的功能至关重要。胆碱还可作为甲基供体甘氨酸甜菜碱的前体，参与单碳代谢。胆碱的缺乏可导致肝损害、神经系统疾病、细胞死亡、以及癌症。奶制品中含有胆碱，婴幼儿的营养摄入量一般仅限于普通牛奶，所以添加胆碱对人体健康非常重要。胆碱的水平异常在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中起重要作用。胆碱含量变化对人体健康和疾病造成很大的影响，因此胆碱的定量测定在临床分析中具有重要意义。胆碱的传统检测方法是色谱法，但该方法存在耗时长、操作复杂、条件苛刻、成本高等问题。相比而言，发展基于生物传感器的分析方法可在一定程度上克服色谱法存在的问题。

当前，基于生物传感器的胆碱分析方法有电化学法、比色法、荧光法、化学发光法等。文献检索表明，Qin等基于金纳米粒子修饰的碳纳米管聚合物构建了电流传感器用于胆碱的测定(Amperometric biosensors based on gold nanoparticles-decorated multi-walled carbon nanotubes-poly(diallyldimethylammonium chloride)biocompositefor the determination of choline,Xia Qin,Huicai Wang,Xinsheng Wang,ZhiyingMiao,Lili Chen,Wei Zhao,Miaomiao Shan,Qiang Chen,Sensors and Actuators B-Chemical,2010,147,593–598)；Sanz-Vicente等依据分析酶促反应中荧光信号的变化，发展了水溶性磷脂胆碱的测定方法(Enzymatic methods for choline-containing watersoluble phospholipids based on fluorescence of choline oxidase:Application tolyso-PAF,Isabel Sanz-Vicente,Andres Domínguez,Carlos Ferrandez,Javier Galban,Analytical Biochemistry,2017,519,30–37)。

尽管当前发展的生物传感器方法可用于胆碱的检测，但这些方法需要昂贵的仪器、耗时和繁琐的操作，由于普遍采用了单信号检测模式，导致了测量结果的不稳定性。单信号检测模式依赖信号的强度来定性和定量目标物的浓度，而其强度往往受到体系和环境条件的影响。基于此，采用双信号强度比值处理即获得信号的比率强度，具备自校准功能，有效消除了自体和背景信号产生的干扰，提高了目标物检测结果的准确性和可靠性。贵金属纳米簇是一种重要的发光纳米材料，具有尺寸依赖的理化性质，因其尺寸小、水溶性好、光稳定性高、具备生物相容性和低毒性等优点，已被广泛用于构建荧光探针。迄今为止，尚未有采用比率荧光探针方法检测胆碱，以及基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针来检测胆碱的国内外文献和专利报道。

发明内容：