[发明专利]一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法

摘要

本发明公开了一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法，该改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：S1：通过1‑2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9‑10^10数量级的PBMCs，取分离好的PBMCs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，S2：标记非CD4+细胞，S3：LD分离柱阴选除去non CD4+细胞，S4：抗体标记CD25+细胞，S5：MS柱阳选CD25+细胞。本发明通过1‑2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9‑10^10数量级的PBMCs，轻松得到传统采血办法100倍以上的单个核细胞，并且由于其他血成分直接回输，避免浪费，对患者总血成分、血细胞计数影响更轻微。

主权项

1.一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法，其特征在于：该改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：S1：通过1‑2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9‑10^10数量级的PBMCs，取分离好的PBMCs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；S2：标记非CD4+细胞：1）用90ul MACS buffer重悬（每107细胞）后，加入10ul Biotin labeled Cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min，2）加入20ul anti‑Biotin microbeads，4℃孵育15min，3）加入1mL MACS buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，4）加500ul Buffer重悬；S3：LD分离柱阴选除去non CD4+细胞：1）取LD column分离柱置于磁场STAND上的大分选器（Separator，紫色）上，加2mL buffer润洗，2）加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mL buffer洗两遍，收集流过分离柱来的所有细胞悬液（即CD4+细胞悬液）包括洗液；S4：抗体标记CD25+细胞：1）上述CD4+细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90ul buffer重悬（每107细胞），2）加10ul anti‑CD25 microbeads（每107细胞），充分混匀，4℃孵育15min，3）加1mL buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，4）加500ul Buffer重悬即得到抗CD25磁珠标记的细胞悬液；S5：MS柱阳选CD25+细胞：取LD column分离柱置于磁场STAND上的小分选器（Separator，绿色）上，加500uL buffer润洗。